miR-374a在糖尿病肾病患者血清中的表达水平及其意义①

郭晓丽，陈维一，许 灿，张 浩，葛欣联，王 翯

(1河北省保定市第一中心医院内分泌一科；2河北省保定市食品药品检验所保化室，河北保定071000）

与2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)相关的长期血管并发症是高血糖对血管损害的结果[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是T2D最常见的微血管并发症之一，也是T2D人群中最常见的终末期肾病病因[2]。DN的特点是肾小球高灌注和高滤过，促进尿液中异常的高蛋白排泄。同时，许多患者还伴有细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-1（Interleukin，IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）显著升高，在合并慢性全身炎症的DN患者中更为明显[3]。黏附分子包括细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管细胞黏附蛋白-1(vascular cell adhesion protein-1，VCAM-1)或E-选择素也参与了DN的生理病理过程。目前尚缺乏早期检测DN的生物学标志物[5]。微小核糖核酸(miRNAs)是多种疾病的预测因子，包括多种癌症类型或心血管疾病。人血清中miRNAs水平稳定，具有可重复性和一致性[6]。本研究旨在探讨miR-374a水平与T2D肾损害的相关性及miR-374a作为DN生物标志物的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年1月－2020年1月河北省保定市第一中心医院收治的44例T2D患者为研究对象（T2D组），所有患者均符合美国糖尿病学会(ADA)制定的《糖尿病医学诊疗标准》[7]。根据是否并发DN，将患者分为无DN组(n=27)及DN组(n=17)，DN的诊断以尿白蛋白/肌酐＞30 mg/g为标准，白蛋白/肌酐30～299 mg/g或≥300 mg/g时，检测2次，分别考虑微量白蛋白尿或大量白蛋白尿。无DN组无其他并发症。根据疾病严重程度，将DN组患者分为大量蛋白尿组（n=10）和微量蛋白尿组（n=7）。选择同期在本院治疗的13例合并视网膜病变且白蛋白尿检查正常的T2D患者为阳性对照（阳性对照组），以测试miR-374a的降低是否是糖尿病肾病患者所特有，并且总体上与微血管并发症有无相关系。排除标准：⑴合并自身免疫性、感染性、血液学、恶性、器质性或炎症性疾病。⑵体质指数（body mass index，BMI）≥40 kg/m2。⑶合并心血管疾病史，包括缺血性心脏病、外周血管疾病、中风和与心血管风险相关的慢性疾病等。⑷发烧、剧烈体育锻炼。选择同期在本院行健康体检的24名非糖尿病健康人为阴性对照组，其年龄及性别组成等基线资料与糖尿病患者相匹配，以评估血清miR-374a水平与T2D患者的潜在差异。所有参加研究的患者及健康人群对本研究均知情同意，并签署知情同意书。所有检测费用由本课题组承担。

1.2 血液样本收集及生化指标检测 隔夜禁食后，从肘前静脉采血，记录受试者体重(kg)、身高(m)、体质指数(kg/m2)、腰围(cm)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、肾小球滤过率的估算值（eGFR)等一般资料。在1 500 g、4℃条件下，离心10 min，用酶法测定血清葡萄糖、血清总胆固醇和甘油三酯水平。糖化血红蛋白(HbA1c)水平通过自动糖化血红蛋白分析仪进行检测。用全自动生化检测仪检测超敏C-反应蛋白（hs-CRP）。用免疫比浊法测定清晨尿标本中的白蛋白水平。

1.3 miRNA的分离及miR-374a的测定 血液样品收集在血清分离管中，在4°C、1 500 g条件下离心10 min，上清液(血清)保存在-80°C直到分析。用miRNasy血清/血浆试剂盒(QIGEN)分离循环中的miRNAs。根据制造商的说明，使用TaqMan Advanced miRNA cDNA合成试剂盒将RNA转换为cDNA。利用快速实时聚合酶链反应系统中用特异的水解探针进行定量聚合酶链反应(QPCR)，反应条件：加热95℃30 min，变性94℃15 s，退火55℃30 s，延伸70℃30 s，共40个循环。用Expression Suite软件2-ΔΔCT方法检测血清miR-374a表达水平。miR-374a引物序列上游3'-CGAGCTGAGTGCGTCCTGTC-5'；下游'-TCGCTGGCCGTGAGTCTGT-5'。

1.4 多形核白细胞分离与计数 将血液样本肝素化后，与3%右旋糖酐孵育45 min。收集上清液，经Ficoll-Hypaque释放，650 g、4℃条件下离心25 min，获得多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes，PMNs)。在细胞颗粒中加入裂解缓冲液，室温孵育5 min，650 g、4℃条件下离心5 min，除去剩余的裂解红细胞。然后将细胞重新悬浮在Hank’s平衡盐溶液中，并用Scepter 2.0细胞计数器进行计数。

1.5 白细胞-内皮细胞相互作用分析 采用白细胞-内皮相互作用的体外模型，在该模型中，每个受试者的分离的PMN以0.36 mL/min的流速灌流到种植在流室底板盖片上的人脐静脉内皮细胞单层上。在实验期间，用连接到倒置显微镜的摄像机，在5 min内曝光并记录内皮细胞单层部分。评估：白细胞滚动速度，连续20个白细胞沿着100μm的曝光场移动所需的时间；白细胞黏附性，与内皮单层结合至少30 s的白细胞数量。

1.6 血清细胞因子检测 用酶联免疫吸附试验检测血清中TNF-α、IL-6和ICAM-1，试剂盒均购于武汉博士德生物科技有限公司，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学分析 使用SPSSStatistics 20.0进行数据统计分析。计数资料用均数±标准差（±s ）表示，使用参数t检验或非参数MannWhitney U检验。两组及两组以上数据的比较采用Kruskal-Wallis检验和Dunnett多重检验。多因素分析用Logistic多因素分析。相关性检验采用pearson相关性分析。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较 两组患者的BMI、腰围、血压、空腹血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇和甘油三酯差异无统计学意义(P＞0.05)。与无DN组比较，DN组hs-CRP、微量白蛋白尿和白蛋白/肌酐比值较高，而EGFR较低（P＜0.05）。见表1。

表1两组患者一般资料比较

2.2 RNA检测验证RNA纯度 定量分析检测显示，总RNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0，表明RNA纯度符合要求。电泳结果显示，在28 s、18 s及5 s处可见完整清晰条带，无扩散现象。见图1。

2.3 不同组患者血清中miR-374a表达水平 T2D组与阴性对照组的miR-374a水平分别为(1.28±0.24)、(1.00±0.17)，差异无统计学意义（P＞0.05）。与无DN组相比，DN患者血清中miR-374a水平降低(P＜0.01)，而阳性对照组的miR-374a水平明显高于DN组(P＜0.01)。当根据疾病的严重程度对DN患者进行亚组分析时，大量蛋白尿组（n=10）患者的miR-374a水平显著低于无DN患者（P＜0.01）及微量蛋白尿组（P＜0.05）。见图2。

图1 RNA变性琼脂糖凝胶电泳

图2不同组患者血清中miR-374a表达水平

2.4 影响miR-374a表达的危险因素分析 miR-374a表达水平与年龄(r=-0.425)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）(r=-0.468)、血 清 总 胆 固 醇（TC）(r=-0.397)、hs-CRP(r=-0.236)、白蛋白/肌酐（r=-0.368）呈负相关(P＜0.05)，与高密度脂蛋白（HDL）(r=0.632)、空腹C肽(FCP)(r=0.523)呈正相关(P＜0.05)。以miR-374a表达水平为因变量，以上述指标为自变量行Logistic多元逐步回归分析，结果发现，hs-CRP、FCP及TC是影响miR-374a表达水平的独立性危险因素。见表2。

表2影响miR-374a表达的危险因素分析

2.5 miR-374a水平与白细胞-内皮相互作用的关系 与无DN组相比，DN组的PMN滚动速度较低(P＜0.05)，黏附性较高(P＜0.01)。miR-374a与PMN滚动速度呈正相关(r=0.625；P＜0.01)，而与PMN黏附性呈负相关(r=-0.457；P＜0.05)。见图3。

2.6 血清miR-374a表达与炎症、黏附分子水平的关系 与无DN组比较，DN组TNF-α、IL-6、ICAM-1水平较高（P＜0.05）。miR-374a与TNF-α(r=-0.592；P＜0.01)、IL-6(r=-0.491；P＜0.05)和ICAM-1水 平(r=-0.687；P＜0.001)呈负相关，这表明miR-374a表达水平与患者的炎症状态密切相关。见图4。

图3 miR-374a水平与白细胞-内皮相互作用的关系

图4血清miR-374a表达与炎症、黏附分子水平的关系

3 讨论

miRNA是内源性非编码RNA，通过靶向mRNA的3'非翻译区（3'-UTR）来调控动物和植物中的基因表达[8]。已经报道显示，DN、多囊肾、肾脏纤维化和药源性肾损伤等肾脏疾病中miRNA有异常表达[9-10]。有多个miRNAs已被发现与DN的病理进程有关。例如，miR-192在肾脏特异表达，并在DN患者中下调，并与纤肾脏维化和EGFR减少有关[11]。同样，T2D相关的高血糖会导致肾脏miR-21表达上调诱发肾细胞肥大和纤维化[12]。上述miRNAs被认为是该疾病的生物标志物，它们在血清中的异常水平可能反映了肾脏损害的潜在进展[13]。它们在血清中的表达水平在糖尿病肾病晚期才发生改变，在微量白蛋白尿患者中并不明显。因此，对诊断早期DN并无太大帮助。

miR-374a在癌症中的研究较多，其可能参与癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡[14]。有学者发现miR-374a可能作为抗凋亡基因在慢性肾脏疾病进展中发挥作用[10]。本研究结果显示，与无DN组相比，DN患者血清中miR-374a水平降低，而阳性对照组的miR-374a水平明显高于DN组。当根据疾病的严重程度对DN患者进行亚组分析时，大量蛋白尿患者的miR-374a水平显著低于无DN患者及微量蛋白尿患者。提示miR-374a与DN的发生和发展相关。

免疫炎症因子紊乱在DN发生过程中起重要作用，DN患者肾脏中NF-κB的炎症信号促使细胞因子、趋化因子和黏附分子的释放，这些分子介导免疫细胞的释放与肾脏组织浸润[15]。类似地，白细胞在炎症情况下迁移到血管壁，这是一个由白细胞和内皮细胞中的黏附分子释放的细胞因子调节的多步骤过程[12]。白细胞滚动和黏附是白细胞募集后发挥功能的重要步骤[16]。本研究发现：miR-374a水平下降与白细胞滚动速度和白细胞与内皮的黏附性增强之间存在一定的相关性；与无DN组比较，DN组TNF-α、IL-6、ICAM-1水平较高；miR-374a相对表达水平与促炎因子TNF-α、IL-6与ICAM-1呈负相关。提示：随着miR-374a表达水平的降低，患者体内炎症反应加重；miR-374a可能参与了DN的发生和发展。

综上所述，血清miR-374a水平与DN的发展有关，miR-374a有望作为DN的一个敏感的生物标志物。今后需要开展细胞和动物研究，进一步分析miR-374a在DN中的作用机制。