线粒体融合基因2在大鼠肺动脉高压模型中的表达及功能分析①

阿里旦·艾尔肯，买尔旦·赛力木，武 云

（新疆医科大学第一附属医院全科医学科，乌鲁木齐830054）

肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是多种原因引起的一种临床综合症，是肺动脉压力升高超过一定界值导致的血流动力学和病理生理改变的机体变化，导致此种机体变化的机制是肺动脉内皮细胞、平滑肌细胞的异常增殖，最终导致肺血管重构，使肺血管阻力增加，可使患者右心衰竭致死亡，主要表现为肺血管阻力增高及右心衰竭，预后极差。其发病率大约为每年100～200万，75%的患者集中在20～40岁[1]。随着人们对PAH研究的深入，逐渐认识到内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在PAH致病机制中起着重要作用，ESR是肺血管重构促进肺动脉高压发生发展的重要病理机制[2-3]。缺血-再灌注损伤、氧化应激、细胞内蛋白合成过多和其他合成屏障或物理、化学和遗传等多种因素均可引发ERS[4-7]。线粒体融合基因2(Mitofusin 2，MFN2)具有促进线粒体融合的功能，与线粒体形态、结构和功能有着密切关系[2]。在哺乳动物中MFN2与Fzo家族蛋白是同源的大分子蛋白，具有促进线粒体融合、细胞增殖抑制、细胞凋亡保护功能[8]，阻抑MFN2可使葡萄糖氧化、线粒体膜电位以及细胞呼吸下降[9]，而MFN2表达增强后，葡萄糖氧化及线粒体膜电位增加；MFN2还存在于线粒体相连的内质网结构表面，维持线粒体和内质网的连接，因此MFN2可影响ERS。本研究通过建立大鼠肺动脉高压的模型，采用已知化学分子伴侣4-苯基丁酸(4-Phenylbutyrate，4-PBA)抑制ERS，探讨内质网-线粒体通路中关键因子MFN2的表达与PAH的关系，以期为治疗PAH提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择健康雄性SPF级Wistar大鼠60只，大鼠体重为180～200 g，均采用新疆医科大学第一附属医院医学研究中心实验动物科学研究部。动物许可证号：SYXK（新）2018－0001。本实验的步骤均经新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准，许可证编码：IACU-20140313005。

1.2 方法 动物模型制备按照文献［10］进行。采用随机数字表将Wistar雄性大鼠进行分组：正常对照组（无任何处理），PAH组（腹腔注射60 mg/kg野百合碱诱导建立PAH模型），PRE组（PAH诱导当天开始每天使用4-PBA，持续4 w）和REV组（PAH诱导第3周每天使用4-PBA，持续2 w。4 w后，4组大鼠采用二氧化碳窒息后颈椎脱位处死，取下肺和心脏样本，在0.9%的冷水中快速清洗。肺组织在液氮中快速冷冻并在－80°C下储存，之后采用实时PCR分析。从右肺门取出的横切组织保存在10%的福尔马林中，采用苏木精-伊红染色。

1.3 主要试剂 98%纯度的野百合碱（生产批号：1001084656，厂家：日本Sigma株式会社）、4-苯基丁酸（生产批号：1011210328，厂家：日本Sigma株式会社）、TRNzol RNA提取试剂（厂家：天根生化科技有限公司）、实时定量PCR引物（厂家：美国Invitrogen公司）、qPCR试剂盒（厂家：大连TaKaRa宝生物工程有限公司）。

1.4 采用仪器 采用BL-420F生物信息采集管理系统（成都泰盟公司制造）、QL-902涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司制造）、Centrifuge 5415D离心机（德国Eppendorf公司制造）、ABI7500荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司制造）。

1.5 检测方法

1.5.1 血流动力学检测方法[11]实验4 w后，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉，使用量为0.045 g/kg，之后测量右心室压和肺动脉压。使用BL-420F生物和功能信息收集系统（TME，中国成都）

1.5.2 实时定量PCR检测[12]以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，使用Trizol试剂提取大鼠的总RNA，RNA扩增采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、ROX plus系统进行。采用95°C下30 s的最先进行酶活化，然后包括在95°C30 sec进行45个循环，在60°C条件下退火和延伸40 s。引物均由北京Invitrogen公司合成。上游引物：5'-GAAGATCTATGTCCCTGCTCTT CTCTCGAT-3'；下 游 引 物：5'-GGAATTCTCTGCTGGGCTGCAGGTACT-3'。以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照，扩增引物为：5'-GGTGAAGGTCGGTGTCAAGG-3'，5'-CAAAGTTGTCATGCATGACC-3'，扩增片段为496 bp。根据PCR仪自动生成的Ct值。

1.5.3 测量方法 处死实验大鼠取出肺脏及心，预冷后生理盐水处理，取心房组织干燥后，分别测量游离右室（right ventricle，RV）、左心室+室间隔（left ventricle+ventricular septum，LV+S）的重量，以右室/（左心室+室间隔）作为右心室肥厚指数。肺组织以10%甲醛溶液固定，之后常规石蜡包埋，染色采用弹力纤维特殊染色法，之后进行切片。测定对象为直径50～100μm的肺小动脉，测量其膜厚度(thickness between internal and external elastic plates,elastic plates,elastic plates,elastic plates,WT)、血管外径（the diameter distance among external elastic plates,ED）、管腔面积（vascular lumen area，LA）、管壁面积（vascular wall area，WA）、管总面积（total vascular area，TA）。肺小动脉重塑指标包括肺小动脉中膜厚度(WT%=2×WT/ED)、管壁面积/管总面积（WA%=WA/TA)、管腔面积/管总面积（LA%=LA/TA)。

1.6 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，各组间比较作方差齐性检验，如方差齐则进行单因素方差分析，如方差不齐，则采用非参数检验（Kruskal-Wallis H检验），各组间比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 实验4 w后4组大鼠血流动力学变化 正常对照组大鼠平均肺动脉压力为（17.07±4.96）mmHg，PAH组大鼠平均肺动脉压力为（56.68±11.62）mmHg，REV组大鼠平均肺动脉压力为（23.18±3.78）mmHg，PRE组大鼠平均肺动脉压力为（37.25±16.51）mmHg，差异有统计学意义（P＜0.05）。正常对照组大鼠平均右心室压力为（8.86±3.92）mmHg，PAH组大鼠平均右心室压力为（28.65±5.89）mmHg，REV组大鼠平均右心室压力为（17.03±9.19）mmHg，PRE组大鼠平均右心室压力为（22.68±9.19）mmHg，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 实验4 w后4组大鼠肺小动脉病理形态及右心室肥厚指数改变情况 4组大鼠WT、ED、TA、LA、WT%、WA%和LA%比较，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

表1 实验4 w后4组大鼠肺小动脉病理形态及右心室肥厚指数改变情况（±s）

表1 实验4 w后4组大鼠肺小动脉病理形态及右心室肥厚指数改变情况（±s）

?

2.3 实验4 w后4组动物肺血管重塑病理指标情况

PAH组大鼠的肺小动脉血管内径和外径增宽，差异有统计学意义（P＜0.05），管壁厚度较正常对照增高；REV组和PRE组大鼠的肺小动脉血管内径和外径增宽距离比较，差异有统计学意义（P＜0.05），PAH组大鼠的血管内径和外径增宽的距离缩短，但管壁厚度与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 实验4 w后4组动物肺血管重塑病理图片

2.4 实验4 w后4组大鼠MFN2表达情况比较 正常对照组大鼠MFN2表达水平为（5.98±0.12），PAH组大鼠MFN2表达水平为（2.01±0.08），REV组大鼠MFN2表达水平为（4.12±0.09），PRE组大鼠MFN2表达水平为（4.58±0.11），差异有统计学意义（P＜0.05），PAH组大鼠的MFN2表达水平较REV组和PRE组大鼠低（P＜0.05）。见图2。

图2 MFN2在MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型中对平均肺动脉压（MPAP）的影响

3 讨论

本研究显示，REV组和PRE组大鼠平均肺动脉压力和平均右心室压力较PAH组大鼠低，但又略高于正常对照组大鼠。原因可能是REV组和PRE组在不同时间采用了4-PBA处理，4－PBA通过抑制PERK信号通路逆转肺血管重构而抑制ERS。REV组和PRE组WT、ED、TA、LA、WT%、WA%和LA%高于PAH组大鼠。PAH组大鼠肺小动脉内、外弹力板之间距离增宽，管壁较正常对照增厚，REV组和PRE组大鼠肺小动脉的内、外弹力板之间距离与PAH组大鼠比较变短，而肺小动脉管壁厚度与正常对照组大鼠管壁厚度差异无统计学意义。这可能因ERS时线粒体接收细胞应激，未折叠蛋白反应时，线粒体发生去极化，线粒体膜的电化学浓度梯度改变，而MFN2可提高线粒体膜电位[13]，提示MFN2参与线粒体融合而抑制ERS，因此其可降低肺血管重构而减少肺动脉高压发生。

本研究显示，PAH组大鼠的MFN2表达水平较REV组和PRE组大鼠低，且3组均低于正常对照组。这主要是因MFN2可能作为信号GTPase调节线粒体融合，其活化可保护线粒体，稳定线粒体膜的通透性，直接参与调节线粒体的自噬[14]。同时关键因子MFN2、线粒体形态与细胞信号级联通路的形态呈现高度整合[15]。一旦发生PAH，Ire-1、ATF-6存在在ER膜上，其可激活PERK信号通路从而使细胞中的蛋白质合成受到抑制，促进发生细胞凋亡途径，参与细胞整合应激反应[16]，大鼠细胞中的关键因子MFN2是重要的抗增殖蛋白，其最重要的作用是干扰Ras信号通路从而使质膜生长因子受体的信号传递中断[17]，因此PAH时MFN2表达降低。

综上所述，大鼠PAH模型中MFN2表达抑制，使血流动力学增加，肺小动脉病理形态改变及右心室肥厚指数增高。但本研究仅观察了大鼠血流动力学变化、肺小动脉病理形态、右心室肥厚指数改变、肺血管重塑和MFN2表达情况等病理生理宏观的改变，对MFN2影响PAH的发生、发展的分子和基因方面的观察仍不深入，另外采用大鼠PAH模型研究MFN2对PAH的影响的结果是否可应用于人体，均需进一步的临床验证。