LOXL2蛋白在食管鳞癌中的表达及临床病理学意义①

刘英敏，年 薇，米尔阿力木江·麦麦提吐尔逊，唐成琼，范志勤

（新疆医科大学第三临床医学院1日间手术病房，2放射物理技术科，乌鲁木齐830011）

食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤[1]，我国每年新发食管癌患者约24.6万人，死亡约为18.8万人[2]，占全球食管癌总发病及死亡人数的一半。我国食管癌的主要病理类型为食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)，占95%以上；欧美国家主要类型为食管腺癌，占75%～85%，病理类型不同，诊治方案及预后截然不同[3]。食管鳞癌患者早期症状不明显，就诊时常已发生局部浸润或远处转移，故食管鳞癌患者预后差，5年生存率仅为20%，其中IV期患者5年生存率小于5%[4]。因此研究食管鳞癌的发病机制，寻找判断预后的有效生物学指标，改善患者生存时间和生存质量尤为重要。赖氨酰氧化酶样蛋白2（lysyl oxidase-like protein 2，LOXL2）是赖氨酰氧化酶（LOX）家族成员之一，LOX是一种分泌型铜依赖性胺氧化酶，通过催化胶原蛋白和弹性蛋白之间的相互交联而促进结缔组织的形成[5]。LOX家族由LOXL1～LOXL4组成，家族成员因结构不同，其功能也存在差异[6]，LOXL2是目前研究最为广泛、最具代表性的成员。越来越多的证据表明LOXL2参与了肿瘤细胞的侵袭、转移和血管生成，以及实体瘤的恶性转化[7]。然而目前关于LOXL2蛋白与食管鳞癌患者预后的研究较少，LOXL2蛋白对预后的影响有待进一步研究。本研究通过免疫组化检测LOXL2蛋白在不同分期食管鳞癌患者的表达水平，分析LOXL2表达与患者的临床病理特征及生存情况，全面探讨LOXL2在食管鳞癌中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集新疆医科大学附属肿瘤医院2015年1月1日－2017年7月31月收治的148例有完整临床病理资料且经病理证实的食管鳞癌患者资料（包括患者基本资料信息、病理结果以及完整的随访调查结果）。本研究纳入106例I～III期食管鳞癌患者和42例IV期食管鳞癌患者，收集I～III期行食管癌根治术患者的癌组织和对应的癌旁组织（距癌组织＞5 cm的正常食管组织）及IV期食管镜下的活检组织，经10%福尔马林溶液常规固定，石蜡包埋。所有患者病理确诊前未行辅助放化疗等治疗。纳入患者年龄区间为37～80岁，中位年龄65岁；其中男性90例，女性58例。临床分期依据2017年第8版AJCC食管癌分期标准：I期为10例、II期为36例，III期为60例，IV期为42例；I、II、III期患者根据术后病理结果进行临床病理分期，IV期患者综合超声内镜检查和/或CT检查确定临床分期。本研究已获得本院伦理委员会批准，伦理审批号：K-201702、K-2019053，所有患者均已签署标本使用知情同意书。

1.2 免疫组化染色和结果评定 采用免疫组化的方法对食管鳞癌标本和癌旁标本进行LOXL2蛋白表达水平检测，LOXL2抗体购自美国ORIGENE公司（编号：TA807443）。操作流程：常规石蜡切片4μm，脱蜡，水化，高压修复，3%过氧化氢（H2O2）阻断内源性过氧化物酶，PBS缓冲液洗涤，滴加一抗4℃冰箱培育过夜（LOXL2抗体工作液浓度1:200），加入二抗孵育30 min，DAB显色，苏术素核复染，镜下观察。选取已知阴性切片作为阴性对照。结果 均由两名高级职称的病理科医师进行双盲判读，其结果取平均值。LOXL2以细胞质有棕黄色颗粒为阳性，根据阳性细胞的比例和着色程度分为4级：（1）癌细胞无细胞膜/细胞质/细胞核染色或≤10%的癌细胞出现细胞膜/细胞质/细胞核染色为(-)；（2）＞10%癌细胞出现细胞质部分染色为(+)；（3）＞10%癌细胞出现细胞质弱、中度完全染色为(++)；（4）＞10%癌细胞出现细胞质高度完全染色为(+++)。其中(-)判为不表达组即阴性，(+)～(+++)判为高表达组即阳性（图1）。

1.3 随访资料 收集患者的病例资料，并根据患者登记的住址、电话号码等对患者或患者联系人进行随访调查，本研究无失访患者，有效随访率为100%。若随访结果发现患者死亡，则视为随访结束，此节点即为随访终点，随访的截止日期为2020年5月31日。总生存期(overall survival，OS)定义为I～III期患者自手术治疗之日和/或IV期患者病理明确之日到各种原因引起死亡的时间。

1.4 统计学分析 所有数据结果采用SPSS22.0统计软件分析，用GraphPad Prism8.0软件作图。计数资料用频数及频率表示，LOXL2表达与患者临床病理特征相关性采用卡方检验或Fisher精确检验，生存分析用Kaplan-Meier生存曲线分析，单因素及多因素预后分析采用Cox回归分析。所有检验均为双侧，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LOXL2在食管鳞癌组织及癌旁组织的表达情况 LOXL2阳性表达主要见于食管鳞癌细胞胞质，胞核较少染色，阳性细胞染色呈棕黄色（图1）。在106对食管鳞癌组织及对应癌旁组织中LOXL2阳性表达比率分别为66.98%（71/106）和37.73%（40/106），癌组织阳性表达率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（χ2=18.173，P＜0.001）。

图1 LOXL2在食管鳞癌癌旁组、癌组织中的表达（×200）

2.2 LOXL2表达情况与食管鳞状细胞癌的临床特征关系 LOXL2在148例食管鳞癌组织的阳性表达率为74.32%（110/148），LOXL2阳性表达与食管鳞癌分化程 度（χ2=15.468，P＜0.01）、肿瘤 浸润 深度（χ2=15.839，P＜0.01）、淋巴结转移（χ2=6.332，P＜0.05）及TNM分期（χ2=18.526，P＜0.01）差异均有统计学意义，LOXL2蛋白表达与患者的年龄、民族、性别和癌胚抗原表达差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.3 LOXL2表达与患者的生存分析 全部患者随访时间为1～64个月，中位随访时间为20个月，148例食管鳞癌患者中108例出现死亡（72.97%）。其中I期患者10例，3例死亡，死亡率为30%；II期患者死亡率为44.44%（16/36）；III期患者死亡率为78.33%（47/60）；IV期患者死亡率为100%（42/42），差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。LOXL2阴性表达组患者中位生存时间为40个月，总生存率为44.74%；而LOXL2阳性组患者中位生存时间为15个月，总生存率为20.90%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图3。

表1 食管鳞癌患者LOXL2表达状态与临床病理特征的关系

图2 食管鳞癌患者不同临床分期生存曲线比较

图3食管鳞癌患者中LOXL2阴性表达与阳性表达的生存曲线比较

2.4食管鳞癌患者预后影响因素 LOXL2阳性表达与肿瘤分化程度、肿瘤浸润程度、有无淋巴结转移和肿瘤TNM分期与总生存期有相关性（P＜0.05），LOXL2的表达状态、肿瘤TNM分期是影响食管鳞状细胞癌预后不良的独立危险因素（HR=2.994，P＜0.01；HR=1.732，P＜0.05），见表2。

表2影响食管鳞癌患者总生存期的Cox分析

3 讨论

食管鳞癌治疗是以手术为主、放化疗为辅，虽然手术方式逐渐微创化，但总生存率未见明显提高，生存获益有限[8]，IV期患者失去手术机会，生存质量更差、生存时间更短。因此，研究食管鳞癌的预后危险因素，寻找新的可信的治疗靶点，提高中晚期患者的疗效和改善患者的预后具有现实意义。LOXL2定位于染色体8p21-22上，是一个由774个氨基酸组成的87 kDa的酶蛋白，通过脱氨基作用致细胞外基质胶原和弹性蛋白交联，诱导上皮-间质转化（EMT），改变细胞形态及细胞间的黏附能力，进而促进肿瘤细胞的转移[9]。LOXL2的高表达与头颈部恶性肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、肝癌等预后不良有关，可以作为预后有效分子标志物，在恶性肿瘤的发生、发展及转移过程中有重要的地位[10-13]。

本研究发现LOXL2表达主要定位于食管鳞癌细胞的细胞质中，染色呈弥漫分布，LOXL2在食管鳞癌组织中阳性率明显高于癌旁组织的。马红等[14]研究发现食管鳞癌及癌旁组织中LOXL2蛋白的阳性表达率分别为83.3%和40%，此结果与本研究结果一致。本研究显示不同临床分期患者LOXL2阳性表达的比例存在差异，I期、II期、III期和IV期患者LOXL2蛋白阳性表达率随着临床分期增加而升高。IV期患者LOXL2阳性率高达92.9%，提示LOXL2阳性表达可促使肿瘤发生远处转移，导致食管鳞癌的恶性程度提高，考虑此结果与LOXL2蛋白阳性表达改变肿瘤微环境，减弱细胞间黏附能力，增强肿瘤细胞侵袭、转移能力有关。本研究进一步分析了LOXL2蛋白表达与临床病理特征的关系，发现LOXL2的阳性表达与肿瘤不同分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移有显著性差异。Torres等[15]研究结果发现LOXL2表达与区域淋巴结转移及临床分期相关，与本研究结果相符，提示LOXL-2蛋白阳性表达参与食管鳞癌细胞的增殖、侵袭与转移。

本研究发现LOXL2阳性表达的患者总生存率明显低于LOXL2阴性表达患者总生存率，提示LOXL2蛋白阳性表达的食管鳞癌患者生存率低、预后差，LOXL2蛋白可以作为预测食管鳞癌预后的有效生物学指标。Cox多因素结果分析提示LOXL2蛋白阳性患者发生死亡的风险是阴性表达患者的1.73倍，LOXL2蛋白阳性表达是食管鳞癌患者预后的独立危险因素。Zhang等[16]一项荟萃分析发现LOXL2蛋白的高表达与多种消化系统肿瘤的临床预后不良密切相关，其高表达是消化系统肿瘤预后差的一个候选指标。

LOXL2参与恶性肿瘤的生物学机制尚不完全明确，目前多数学者认为LOXL2在肿瘤细胞中过表达可通过多种途径促进其恶性生物学转化[17]，当肿瘤体积超过1～2㎜3时，肿瘤细胞处于缺氧微环境，HIF-1α被激活，与LOXL2基因启动子区的低氧应答元件结合，增加LOXL2表达[18]。

综上，本研究证实LOXL2蛋白在食管鳞癌组织中阳性表达率高，LOXL2蛋白阳性表达与食管鳞癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关；LOXL2阳性表达的患者总生存期更短、预后差，LOXL2阳性表达是食管鳞癌的独立预后危险因素。但本研究存在一定的局限性，后期将扩大样本量证实LOXL2表达在食管鳞癌中的作用，从分子层面探讨LOXL2在促进食管鳞癌转移侵袭的生物学机制。