基于网络药理学的葛根芩连汤治疗腹泻作用机制研究

董永丽，史海霞，王 敏，刘全喜

(1.中国中医科学院望京医院，北京 101002；2.北京市中西医结合医院，北京 100039)

腹泻是由一种或多种病因引起的常见消化道疾病症状，可根据病程分为急性腹泻和慢性腹泻两类，临床多表现为排便次数增多，粪便量增加，便溏稀，大便可伴有黏液、脓血或未消化的食物[1-2]。西医常用治疗方式主要集中在使用相关抗生素、止泻药物、补液纠正水电解质和酸碱失衡的对症和营养支持治疗[2]。针对慢性腹泻的治疗，长期使用化学类药物会加速肠道病原菌耐药性的产生，不利于后期临床获益[3]。

中药具有毒性低，不易产生耐药性，其含有的多种天然有效活性成分可起到多靶点、多途径、协同作用的优势，使腹泻治疗相关中药复方成为本领域的研究热点[3]。腹泻在中医属“泄泻”范畴，又称“下利”“飧泄”“注泄”等，可从外感、内伤分为多种不同证候类型，基本病机为脾胃受损、湿困脾土导致肠道功能失调[4-5]。葛根芩连汤出自《伤寒论》，外可解肌表之邪，内可清阳明之热[6]。研究表明，葛根芩连汤在治疗腹泻方面有显著疗效，针对小儿轮状病毒感染性肠炎，葛根芩连汤可显著缩短小儿腹泻、发热及呕吐时间[7-9]。对于急性胃肠炎，葛根芩连汤高于90%的有效率与单纯使用西药治疗相比优势明显[10-11]。溃疡性结肠炎患者在服用葛根芩连汤治疗后，临床症状缓解较快，血常规的白细胞及便常规的红白细胞计数也在短时间内恢复至正常水平[12-14]。现代研究发现，葛根芩连汤的组成药物含有的有效中药成分包括异黄酮类、生物碱类、黄酮类、甘草酸等，之所以能够快速有效的发挥止泻作用可能与其多成分多靶点作用有关[15-17]。同时，葛根芩连汤中的葛根素和黄芩苷还具有良好的抗炎作用，能降低多种致炎因子的血清含量[18-19]，还能通过抑制乙酰胆碱所致的肠道过强蠕动达到止泻的目的[20]。由此可见，葛根芩连汤在治疗腹泻中显示的良好疗效与中药多成分多靶点协同发挥作用密不可分，因此，本研究借助网络药理学研究葛根芩连汤治疗腹泻的作用机制，为中医药治疗临床疾病提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 葛根芩连汤中药复方的有效化学成分及潜在靶点的确定 基于中药系统药理学数据库分析平台(Traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)分别确定“葛根”“黄芩”“黄连”“甘草”四个药物的所有化学成分，定义药物口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(Drug-likeness，DL)≥0.18，筛选活性较高的化学成分。通过Uniprot数据库分别检索各靶点人类基因的简称，明确葛根芩连汤潜在靶点。

1.2 腹泻疾病相关靶点的查询 以“Diarrhea”为关键词依次检索OMIM数据库、GeneCards数据库和DisGeNET疾病数据库，获取腹泻目前确定的所有疾病靶蛋白。利用Venny2.1在线软件删除三个数据库重复的疾病靶点，确定最终的疾病靶点。

1.3 葛根芩连汤-腹泻共同作用靶点的确定及关系网络的构建 使用在线绘图软件Venny 2.1整合药物与疾病的共同靶点，确定葛根芩连汤与腹泻的共同靶点，绘制韦恩图。利用Cytoscape 3.7.1绘图软件构建药物成分-靶点-疾病网络图，使葛根芩连汤作用于腹泻的靶点关系可视化。

1.4 蛋白互作网络的构建 将葛根芩连汤与腹泻的共同靶点导入STRING 11.0在线软件，设置蛋白种类为“homo sapiens”，获得蛋白互作信息图。根据蛋白作用关系调整置信度蛋白质参数，初步设置参数为>0.7，确保研究数据的可靠性。

1.5 基因本体功能富集分析与京都基因与基因组百科全书通路富集分析 基因本体(Gene ontology，GO) 是基因本体论联合会建立的一个数据库，旨在建立一个适用于各种物种的、对基因和蛋白功能进行限定和描述的语义词汇标准。GO注释分为三大类，分别是：分子生物学功能(Molecular function，MF)、生物学过程(Biological process，BP)和细胞学组分(Cellular components，CC)。通过Metascape基因注释软件，对与腹泻相关的葛根芩连汤药对“活性成分-潜在靶点”网络中的蛋白进行GO功能富集分析。京都基因与基因组百科全书 (Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合数据库。KEGG分析目的在于对探讨治疗腹泻的生物学过程及关键信号通路。通过Cytoscape 3.7.1软件中的“Clue GO”插件对关键靶点进行KEGG信号通路分析，获得显著富集的信号通路(P<0.05)。

2 结 果

2.1 葛根芩连汤化学成分及潜在靶点的确定 通过TCMSP数据库初步检索到已知的葛根芩连汤有效活性成分489个，其中符合条件的化学成分共146个，删除重复的后共剩余121个，按照类药性的大小依次降序排列排名前20的生物活性成分，见表1。

2.2 葛根芩连汤与腹泻疾病共同靶点的预测 将以上121种生物活性成分使用TCMSP靶点预测指令进行靶点预测。其中葛根47个，黄芩85个，黄连158个，甘草199个，去除重复共获得221个靶蛋白。经OMIM数据库、GeneCards数据库、DisGeNET查询腹泻相关靶点共5555个，查重后获得5217个靶点。通过Venny取交集得到葛根芩连汤中参与腹泻的靶点182个(图1)。

表1 葛根芩连汤部分生物活性成分(前20名)

2.3 药物-疾病共同靶点确定及网络构建 将获得的共同靶利用Cytoscape 3.7.1网络绘图软件绘制并分析葛根芩连汤干预腹泻成分-靶点网络图。红色多边形表示疾病，黄色箭头代表葛根芩连汤活性成分，绿色椭圆表示各成分基因靶点，蓝色菱形表示葛根芩连汤的药物组成，作用关系分别用蓝色、黄色、红色线条连接。该网络包括节点289个，靶点间共存在3500条相互作用线(图2)。

图1 药物预测靶点与疾病靶点韦恩图

2.4 葛根芩连汤腹泻靶点PPI网络构建及聚类分析 通过STRING 11.0数据库在线检索蛋白质(已知蛋白和预测蛋白)之间相互作用的数据库，初步构建葛根芩连汤治疗腹泻的PPI网络图形，在Export模块中，导出PNG格式的蛋白互作网络关系图，文本文件保存为TSV。将STRING 11.0构建的蛋白互作网络图导入Cytoscape软件的MCODE插件利用网络聚类算法，对相应的功能模块进行美化调整，直观的反应葛根芩连汤干预腹泻的作用机制。其中利用STRING 11.0构建的蛋白网络共包括：该网络图中包含182个，1388条关系线条，预期边缘356个，PPI浓缩p<1.0e-16，进一步聚类分析预测出葛根芩连汤中的AKT1、CASP3、JUN、PTGS2、RELA、ESR1可能为治疗腹泻的核心关键蛋白(图3)。

图2 药物-化合物-靶点-疾病靶点网络图

图3 核心蛋白柱状图

2.5 生物通路富集分析 GO富集分析显示(图4),生物过程确定了157个GO条目，主要包括生物调节(Biological regulation)、细胞代谢(Neurotransmitter metabolism)、蛋白质结合(Protein binding)、离子结合(Ion binding)、信号受体结合(Signaling receptor binding)。

KEGG 信号通路分析结果(图5),共确定167条信号通路，通路图像中的富集程度用颜色深浅来表示，颜色越深说明富集程度越好，不同颜色节点表示不同通路。葛根芩连汤治疗腹泻的核心靶点主要通过IL-17信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、内分泌抵抗、Th17细胞分化、细胞凋亡与衰老信号通路作用于疾病。

图4 葛根芩连汤药对干预腹泻GO分析柱状图

图5 葛根芩连汤药对干预腹泻KEGG分析柱状图

3 讨 论

腹泻是消化系统疾病最常见的疾病之一，腹泻的影响因素众多，西医治法以对症治疗为主，治疗方案局限，尤其是针对长期反复发作的慢性腹泻，单一西药无法取得满意的临床疗效[21]。葛根芩连汤是中医临床治疗急慢性肠炎、细菌性痢疾等具有腹泻症状的胃肠疾病的经方，尤善于祛除湿热浊邪[22]。本方以性甘凉，归胃经的葛根为君药，升发脾胃清阳之气，促进肠道运动排泄糟粕；以黄连、黄芩为臣药，取二者苦寒之性起到燥湿止泻的目的，又可兼顾调畅肝胆气机，使湿热之邪不易壅滞；以甘缓和中的甘草为佐使药调和诸药药性，四药共奏外疏内清之功[23]。葛根芩连汤以其精妙的组方及明确的疗效，广泛应用于临床，但其作用机制尚未完全明确，网络药理学是一种能够为中医学从基于经验的医学迈向基于证据的医学提供新的途径的强大工具[24-25]。通过网络药理学分析，构建中药与疾病的网络关系，挖掘葛根芩连汤中的复杂成分之间的联系，从现代医学的角度为葛根芩连汤的组方及疗效作用进行了新的科学解析。

葛根芩连汤首载于《伤寒论》：“太阳病，桂枝证，医反下之，利遂不止，脉促者，表未解也；喘而汗出者，葛根黄芩黄连汤主之”。本方有解表清里之功，主治身热下利，胸脘烦热，口中作渴，喘而汗出的病证，为太阳、阳明经药。君药葛根的主要化学成分包括异黄酮类、香豆素类、生物碱类、芳香类等类别有效成分，具有增加血流量、改善微循环、缓解肌肉紧张、增强免疫力、减轻发热、抑制炎症反应的作用[26-27]。黄芩、黄连中药物主要化学成分为黄芩素类、汉黄芩苷、黄芩黄酮、木蝴蝶素、生物碱、木脂素、香豆素、萜类、甾体、有机酸、挥发油、多糖等[28]。通过TCMSP筛选发现葛根芩连汤主要通过芒柄花黄素(Formononetin)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、3’-甲氧基大豆素(3’-methoxydaidzein)、大豆甙元-4’，7-二葡萄糖甙(Daidzein-4’，7-diglucoside)的AKT1、CASP3、JUN、PTGS2等核心靶点的IL-17信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、内分泌抵抗、Th17细胞分化、细胞凋亡与衰老信号通路等通路作用于腹泻相关疾病。

通过构建葛根芩连汤“药物-成分-靶点-疾病”网络图，得出葛根芩连汤的有效成分121个，基因靶点221个，其中作用于腹泻的潜在基因为182个，占全部靶点的80%以上，验证了葛根芩连汤中药复方的临床有效性。脾主运化，胃主储藏腐熟水谷，小肠主分清别浊，大肠主传导，脏腑协调则气机条达。葛根走脾、胃二经，黄芩、黄连苦寒，主清利肠道，甘草甘缓止痛，有降低肠道蠕动，抑制机体炎性反应，修复、重建损伤的肠道平衡的功效[29]。现代药理研究认为，葛根芩连汤的抗病毒、抗菌、增强免疫力的作用，能够明显缩短湿热型急性感染性腹泻的病程，避免抗生素使用不当而继发菌群失调[30]。葛根芩连汤治疗腹泻的核心靶点主要包括AKT1、CASP3、JUN、PTGS2、RELA、ESR1等靶点基因，通过GO富集分析发现主要参与DNA、RNA的转录，聚合酶Ⅱ特异性，细胞因子受体结合，酶与辅酶的结合，酰胺结合过程。说明葛根芩连汤对于腹泻的治疗作用主要是通过抑制炎性基因的酶活性，调控炎症基因的转录，完成细胞修复与再生，从分子层面上消除腹泻相关症状，符合中医治病求本的辨证诊疗思路。

KEGG信号通路分析发现，葛根芩连汤作用通路主要分为病毒感染相关通路、细菌感染与修复相关通路、癌症相关通路以及细胞再生与修复通路。其中，Salmonella infection、Shigellosis和Pathogenic Escherichia coli infection信号通路均为常见的细菌性痢疾通路，分别为沙门杆菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌作用通路，其中葛根芩连汤的潜在三者的作用靶点均在20个以上，主要通过抗炎免疫、抑制肠道平滑肌收缩，缓解腹泻、腹痛的症状；PI3K-Akt信号通路可能通过降低肠道组织黏膜水肿和微血管通透性，诱导TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，抑制细胞凋亡，对脂多糖诱导的急性胃肠炎症具有保护作用[31]。IL-17信号通路属于炎症介导通路，主要通过活化T细胞、刺激Th17的分泌，加快成纤维细胞、IL-6等细胞因子产生炎症反应，引起肠道内环境的破坏[32]。TNF、Apoptosis和Cellular senescence信号通路与机体内细胞因子分泌、细胞代谢、细胞凋亡密切相关，发生病变的胃肠道黏膜通过释放TNFα等细胞因子，活化巨噬细胞，促使的细胞毒作用的发生，最终导致细胞的凋亡[33-34]。其他相关性较高的信号通路，目前尚未发现相关文献报道，需要进一步探索，以证实其作用机制。

对于腹泻的治疗应坚持中西并用，传承创新，充分发挥中西医结合的优势，最大利用中药复方多靶点，多功效的特点。葛根芩连汤治疗腹泻的靶点复杂，通路多样，本研究借助网络药理学初步明确了葛根芩连汤的抗炎免疫机制，主要起到抗炎、缓解肌肉痉挛的作用，具体分子机制尚未验证，后期完善需要借助分子对接及分子生物学研究，完善葛根芩连汤的作用机制，明确葛根芩连汤治疗腹泻的核心通路。