5-氮杂-2′-脱氧胞苷对宫颈癌细胞增殖及N-ras、c-myc基因表达的影响

张谷香，李书萍，李 波，肖松舒

(1.长沙市第四医院妇产科，湖南 长沙 410006；2.中南大学湘雅三医院妇产科，湖南 长沙 410000)

宫颈癌是女性生殖系统的高发肿瘤疾病，居全球女性癌症相关死亡原因的第2位。根据不完全研究结果显示，我国宫颈癌发病人群出现低龄化，经济发展落后国家宫颈癌发病率高于发达国家[1]。目前，宫颈癌的发病机制尚不明确，但已证实其与癌基因表达激活存在一定关联，对宫颈癌患者进行多个癌基因监测发现，超过60%的宫颈癌患者存在1个或多个癌基因放大或激活，已知的相关癌基因有N-ras及c-myc等[2]。研究表明，激活的N-ras基因能够发生突变，通过改变其下游因子的活性，导致肿瘤细胞发生侵袭和增殖[3]。c-myc是一种重要信号调节因子，能够加快恶性肿瘤分化及血管生成。既往研究显示，c-myc在肝癌、肺癌及乳腺癌等疾病中表达异常[4]。因此，了解N-ras、c-myc在宫颈癌发生、发展中的作用机制具有重要意义。5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)属于基因甲基化抑制物，实验证实5-Aza-CdR具有改善白血病病情的作用[5]，但其在实体恶性肿瘤中的应用较少，5-Aza-CdR对N-ras、c-myc癌基因的影响也鲜有报道，因此，本研究通过观察不同浓度5-Aza-CdR对体外培养宫颈癌细胞增殖及N-ras、c-myc基因的影响，探讨5-Aza-CdR对宫颈癌的治疗作用及可能机制，为5-Aza-CdR在宫颈癌治疗中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂及仪器宫颈癌Hela细胞株购自美国ATCC公司，胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco公司，达尔伯克改良尹格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)、细胞CO2培养箱购自Thermo Forma 公司，四甲基偶氮唑盐(tetrame thylazolium salt，MTT)试剂、二甲基亚砜(dimethylsurfoxide，DMSO)及酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自上海蔚霆生物公司，5-Aza-CdR购自美国Simga公司，兔抗人c-myc、N-ras抗体及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购自上海晶抗生物工程有限公司，反转录试剂盒和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒购自美国Promega公司，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及聚偏二氟乙烯膜购自默克化工技术(上海)有限公司；流式细胞仪购自德国Sysmex Partec公司，实时荧光定量PCR仪、Trans-Blot Turbo蛋白质转印仪、ChemiDoc XRS+凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组将低温冷藏的Hela细胞快速移入37 ℃水中溶解，3 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，加入DMEM培养，使细胞贴壁生长，隔日更换培养液，待细胞生长至铺满培养瓶底部90%时，用胰蛋白酶消化，按照13传代培养。取对数生长期细胞按每孔2.5×103个细胞接种于96孔板中，随机分为对照组、低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组，胰蛋白酶消化后，分别加入含0、1、5、10 μmol·L-1的5-Aza-CdR的胎牛血清培养基，置于37 ℃、含体积分数5% CO2的培养箱中继续培养24 h，收集细胞用于后续实验。

1.2.2 MTT法检测Hela细胞增殖能力取培养24 h后的各组Hela细胞，胰蛋白酶消化后按每孔2×104个细胞接种于96孔板，设置6个复孔，置于恒温培养箱中培养，分别于培养24、48、72、96、120 h时于检测孔中加入20 μL(5 g·L-1) MTT，37 ℃继续培养4 h，弃上清液，每孔中加入 200 μL DMSO，充分摇匀，应用全自动酶标分析仪检测波长490 nm 处吸光度值。吸光度值越大，代表细胞增殖能力越强。

1.2.3 流式细胞仪检测Hela细胞凋亡情况取培养24 h后的各组Hela细胞，胰蛋白酶消化4 h后接种于96孔板，每孔2×104个细胞，设置6个复孔，加入5 μmol·L-1Annexin V标记液及10 μmol·L-1P溶液，室温下避光孵育20 min，TBS缓冲液冲洗，采用流式细胞仪检测Hela细胞凋亡率，实验重复6次，取均值。

1.2.4 免疫印迹法检测Hela细胞中N-ras、c-myc蛋白表达取培养24 h后的各组Hela细胞2×104个，加入胰蛋白酶裂解，用总蛋白提取试剂盒提取细胞中总蛋白，应用Bradford法检测蛋白定量。取各组细胞总蛋白50 μg，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至聚偏二氟乙烯膜上，2.5 mg·L-1的脱脂奶粉封闭40～60 min，分别加入鼠抗人c-myc抗体(12 000)、兔抗人N-ras抗体(12 000)、GAPDH抗体(1500 )，4 ℃孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(tris buffered saline with Tween 20，TBST)冲洗，加入过氧化物酶标记的二抗(12 000)，孵育60 min，TBST冲洗3次，加入电化学发光液，避光反应20 min，曝光充分后拍照。使用ChemiDoc XRS+凝胶成像系统分析条带灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。实验重复6次，取均值。

1.2.5 实时荧光定量PCR法检测Hela细胞N-ras、c-myc mRNA相对表达量取培养24 h后的各组Hela细胞2×104个，加入细胞裂解液，使用TRIzol总RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，检测总RNA纯度，取合格样品，反转录试剂盒反转录为模板链 cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR。N-ras上游引物序列为5′-GCACTGACAAGCTAATCCA-3′，下游引物序列为5′-GTCCAACAAACAGGTTTCACCATC-3′；c-myc上游引物序列为5′-GCAGCTGCTTAGACGCTGGA-3′，下游引物序列为5′-CGCAGTAGAAATACGGCTGCAC-3′；内参β-action上游引物序列为5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′，下游引物序列为5′-GTCACGCACGATTTCCGCT-3′。第1个循环为95 ℃预变性5 min，接着行38个PCR循环：95 ℃变性30 s，60 ℃延伸30 s。采用2-ΔΔCt法计算各组细胞中N-ras、c-myc mRNA相对表达量。实验重复6次，取均值。

1.2.6 ELISA法检测Hela细胞上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)水平取培养24 h后的各组Hela细胞， 3 000 r·min-1离心10 min后，取上清液，置于EP管中低温保存，加入0.01 mmol·L-1磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)稀释的抗IgG抗体，4 ℃过夜，用含体积分数1%胎牛血清的PBS溶液封闭60 min后，弃去封闭液，加入TGF-β1、PGE2待测样品各100 μL，室温静置 2 h，避光显色30 min后，终止反应，使用酶标仪检测波长450 nm处吸光度值。根据已知标准蛋白浓度的吸光度值绘制标准曲线，并根据标准曲线计算各组细胞上清液中TGF-β1、PGE2水平。实验重复6次，取均值。

2 结果

2.1 5-Aza-CdR对Hela细胞增殖能力的影响结果见表1。培养24 h时4组Hela细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)。培养48、72、96 h时，低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞增殖能力低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞增殖能力显著低于低剂量5-Aza-CdR组和中剂量5-Aza-CdR组，差异均有统计学意义(P<0.05)。培养24 h时，中剂量5-Aza-CdR组与低剂量5-Aza-CdR组Hela细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)；培养72、96 h时，中剂量5-Aza-CdR组Hela细胞增殖能力显著低于低剂量5-Aza-CdR组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 4组Hela细胞增殖能力的比较

2.2 5-Aza-CdR对各组Hela细胞凋亡的影响结果见图1。对照组、低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞凋亡率分别为(6.71±0.10)%、(12.50±0.25)%、(16.33±0.34)%、(29.02±0.55)%；4组Hela细胞凋亡率比较差异有统计学意义(F=3 542.000，P<0.05)；低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞凋亡率显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量5-Aza-CdR组Hela细胞凋亡率显著低于中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量5-Aza-CdR组Hela细胞凋亡率显著低于高剂量5-Aza-CdR组，差异有统计学意义(P<0.05)。

A:对照组；B：低剂量5-Aza-CdR组；C：中剂量5-Aza-CdR组；D：高剂量5-Aza-CdR组。

2.3 各组Hela细胞中N-ras、c-myc蛋白相对表达量比较结果见图2。对照组、低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞中N-ras蛋白相对表达量分别为1.00±0.00、0.821±0.40、0.64±0.06及0.35±0.06，c-myc蛋白相对表达量分别为1.00±0.00、0.88±0.06、0.67±0.04及0.44±0.07。4组Hela细胞中N-ras及c-myc蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=199.500、120.400，P<0.05)；低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞中N-ras及c-myc蛋白相对表达量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量5-Aza-CdR组Hela细胞中N-ras及c-myc蛋白相对表达量高于中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量5-Aza-CdR组Hela细胞中N-ras及c-myc蛋白相对表达量高于高剂量5-Aza-CdR组，差异有统计学意义(P<0.05)。

1:对照组；2：低剂量5-Aza-CdR组；3：中剂量5-Aza-CdR组；4：高剂量5-Aza-CdR组。

2.4 各组Hela细胞中N-ras、c-myc mRNA相对表达量比较对照组、低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞中N-ras mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、0.73±0.04、0.55±0.03及0.30±0.06，c-myc mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、0.800±0.06、0.630±0.04及0.400±0.00。4组Hela细胞中N-ras及c-myc mRNA相对表达量比较差异有统计学意义(F=285.600、168.500，P<0.05)；低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞中N-ras及c-myc mRNA相对表达量低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.001)；低剂量5-Aza-CdR组Hela细胞中N-ras及c-myc mRNA相对表达量高于中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量5-Aza-CdR组Hela细胞中N-ras及c-myc mRNA相对表达量高于高剂量5-Aza-CdR组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 各组Hela细胞上清液中TGF-β1、PGE2水平比较结果见表2。4组Hela细胞上清液中TGF-β1及PGE2水平比较差异有统计学意义(F=821.000、19.360,P<0.05)。低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量 5-Aza-CdR组Hela细胞上清液中TGF-β1水平高于对照组，PGE2水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；低剂量5-Aza-CdR组Hela细胞上清液中TGF-β1水平低于中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组，PGE2水平高于中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量5-Aza-CdR组Hela细胞上清液中TGF-β1水平低于高剂量5-Aza-CdR组，PGE2水平高于高剂量5-Aza-CdR组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 4组Hela细胞上清液中TGF-β1、PGE2水平比较

3 讨论

近年来，宫颈癌的发病率呈现逐年上升趋势，对患者的生命健康造成了极大的威胁[6]。宫颈癌患者临床多采用手术、放射治疗和化学治疗，这些治疗方法能够在一定程度上改善病情，但存在诸多毒副作用，因此，寻找有效、安全的治疗方法至关重要。5-Aza-CdR属于基因甲基化抑制物，研究证实5-Aza-CdR具有改善白血病病情的作用[5]，但其在实体恶性肿瘤中的应用较少，因此，本研究通过观察不同浓度5-Aza-CdR对体外培养宫颈癌细胞增殖及癌基因N-ras、c-myc水平的影响，探讨5-Aza-CdR对宫颈癌的治疗作用及其机制。

肿瘤的形成与DNA甲基化有关，DNA甲基化能加快肿瘤细胞DNA转录及突变，导致染色体不稳定，促进肿瘤细胞恶变，加快肿瘤生长[7]。5-Aza-CdR在人体DNA复制的过程中可与DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,dnmt1)结合产生复合物，从而发挥抑制甲基转移酶上调、诱导低甲基化形成的作用[8]。目前，关于5-Aza-CdR的研究领域主要局限于血液恶性肿瘤疾病，原因是对5-Aza-CdR研究缺少靶向性，毒副作用较大[5]。既往研究表明，5-Aza-CdR能够通过抑制p16水平，有效抑制Hela细胞增殖及侵袭，加快Hela细胞凋亡[9-10]。尹向梅[11]研究表明，5-Aza-CdR可通过激活p53、p21信号通路抑制人乳头瘤病毒 E6水平来抑制宫颈癌细胞的增殖。本研究结果显示，低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞增殖能力均显著低于对照组，凋亡率均显著高于对照组，并呈现剂量依赖性，进一步证实 5-Aza-CdR能够有效抑制Hela细胞增殖，促进Hela细胞凋亡。

N-ras是ras基因家族成员之一，主要在氨基酸残基中表达并具有高度保守性[12]。研究证实，N-ras具有致癌作用，其表达上调途径与Ras鸟苷酸释放蛋白1信号干预正常细胞周期相关，可导致Smad核转位，诱导肿瘤的发生[13]。c-myc基因是myc家族成员之一，属于可移位的基因，能够使细胞无限分化，促进细胞分裂。研究发现，c-myc是正常细胞向肿瘤细胞生长的中心环节[14]。5-Aza-CdR作为一种天然的胞嘧啶物质，能够减少DNA甲基化活性，活化肿瘤细胞中沉默的抑制癌细胞的基因。彭峰等[15]研究发现，5-Aza-CdR能够减少肺癌细胞中c-myc基因表达。ZHU等[16]研究发现，5-Aza-CdR能够降低c-myc、N-ras水平，抑制宫颈癌细胞甲基化，减少宫颈癌p16等基因表达，加快癌细胞凋亡，降低细胞活性，抑制宫颈癌细胞无限制生长。本研究结果显示，低剂量 5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组c-myc、N-ras蛋白和mRNA相对表达量均显著低于对照组，且随着5-Aza-CdR浓度增加，c-myc、N-ras蛋白和mRNA水平呈剂量依赖性地显著降低。这进一步证实，5-Aza-CdR可能是通过抑制N-ras及c-myc活性而抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞凋亡。

TGF-β1是一种多功能的细胞因子，可调节细胞生长和分化。TGF-β1配体激活及其与Ⅱ型受体结合磷酸化增加了TGF-β1受体活性，TGF-β1与Smad 4缔合形成Smad复合物，该Smad复合物易位至细胞核，并与其他转录因子发生协同作用，调节不同靶基因的启动子，构成了经典的TGF-β1/ Smad4信号通路，TGF-β1/ Smad4信号通路可调节细胞增殖，对正常宫颈上皮细胞有强效的抑癌作用，因此，推测宫颈癌患者存在TGF-β1/ Smad4信号通路的失调。研究发现，TGF-β1过表达能够抑制宫颈癌细胞活性，并与宫颈癌细胞发生淋巴转移等癌细胞转移密切相关[17]。PGE2作为一种重要的炎症介质，通过与前列腺素受体结合后发挥生物学作用，可促进炎症细胞、成纤维细胞及平滑肌细胞等的增生[18-19]。PGE2不仅与炎症的发生、发展相关，而且与肿瘤的发生、发展也密切相关，可以促进肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管的形成和侵袭转移，其在多种肿瘤中均呈高表达。邹余粮等[20]研究发现，PGE2在宫颈癌患者血清和癌组织中均呈显著低表达。目前，关于5-Aza-CdR 对宫颈癌细胞中TGF-β1及PGE2水平的影响的研究报道较少。本研究结果显示，与对照组比较，低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞上清液中TGF-β1水平升高、PGE2水平降低，且随5-Aza-CdR浓度增加，TGF-β1呈剂量依赖性升高，PGE2水平呈剂量依赖性降低，说明5-Aza-CdR 能够降低Hela细胞中PGE2水平、提高TGF-β1水平，并通过这种机制阻碍肿瘤细胞的生长及血管再生，从而对宫颈癌起到治疗作用。

综上所述，5-Aza-CdR能够通过抑制N-ras及c-myc活性，抑制宫颈癌细胞增殖，促进细胞凋亡，且呈剂量依赖性，其机制可能与TGF-β1水平升高、PGE2水平降低相关，但是其机制还需进一步研究。