基于有效基准特征图谱质量表征的江香薷饮片质量评价研究

李文霞 孔静 武秋红 王梦林 路东波 孙仁弟 黄广伟 李思潼 范圆圆 黄玉娟 高园园 刘路路 陈思玉 姜艳艳 石任兵

香薷为唇形科植物石香薷MoslachinensisMaxim.或江香薷ModachinensisMaxim.cv.jiangxiangru的干燥地上部分，前者习称“青香薷”，后者习称“江香薷”。本文主要基于江香薷进行质量评价研究，其性辛，微温，药食兼用，属于药食同源物品，具有发汗解暑、行水散湿、温胃调中的功效，临床多用于抗菌、抗病毒、调血脂、降低胆固醇、抗氧化、增强免疫等；其主要成分含有酚酸类、黄酮类、萜类，此外还含有苯丙素类、脂肪酸等[1-7]。2015版、2020版《中国药典》一部以江香薷中挥发油成分对其进行质量标准控制；文献报道主要对其挥发油中单萜类成分(香荆芥酚、麝香草酚)与黄酮类成分进行含量测定[8-11]。

为了能整体、有效、精准地表征与评价中药质量，本课题组基于自然药学观药物体系理念，相继建立了中药质量表征模式、方法与应用[12-28]。笔者在基于活血药效对江香薷饮片进行药物体系研究时发现，其活血药效的药学架构主要为其酚酸类、黄酮类及萜类成分。本文研究中以确定有活血药效的江香薷饮片作为饮片基准(S5)，以饮片基准中黄酮类有效特征指标性成分黄芩素-7-甲醚作为质量表征基准点，采用HPLC-PDA建立江香薷有效基准特征图谱，其 15个共有特征峰及其7个特征代表性成分涵盖了酚酸类、黄酮类及萜类三种主要化学类型；以黄芩素-7-甲醚对照品模拟基准点的有效基准特征图谱质量表征信息，作为江香薷饮片的质量基准标尺，并对其准确性进行佐证及质量评价应用与验证。所建立的有效基准特征图谱质量表征模式、方法，可整体、有效、精准、简易地对江香薷饮片进行质量评价与筛选。

1 材料

1.1 主要的仪器

Waters e2695 自动进样高效液相色谱仪，2998PDA 检测器，Empower 工作站，Sartorius BT 25S 型 1 /100 000 电子分析天平( 北京赛多利斯仪器有限公司) ，AL204 型1 /10 000 电子分析天平(上海梅特勒-托利多有限公司)，KQ-500 DE 型数控超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司)，RE-52 A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；ZNHW型智能恒温电热套(郑州恒岩仪器有限公司)。

1.2 主要的试药与试剂

咖啡酸(批号：Y09J8C28349，纯度≥98 %)、异迷迭香酸苷(批号：R02M9F60399，纯度≥98 %)、野黄芩苷(批号：Z17O7XX22900，纯度≥98 %)、迷迭香酸(批号：S03N8H47130，纯度≥98 %)、黄芩素-7-甲醚(批号：P15J8F38064，纯度≥98 %)、 香荆芥酚(批号：Z13M8H35994，纯度≥98 %)、麝香草酚(批号：TN1112CB14，纯度≥98 %)对照品均购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈(色谱纯，Fisher Scientific 公司)；分析甲醇(购自北京化工厂)；磷酸(北京化学试剂公司)；娃哈哈水( 杭州娃哈哈集团有限公司)。

14批江香薷饮片分别购自北京市各药店，见表1，并经北京中医药大学刘春生教授鉴定所购江香薷饮片均为正品，饮片标本现存于北京中医药大学中药学院中药化学系。

2 方法和结果

2.1 有效基准特征图谱质量表征方法的建立

2.1.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取咖啡酸、野黄芩苷、迷迭香酸、黄芩素-7-甲醚、香荆芥酚、麝香草酚各对照品4.56 mg、2.04 mg、11.04 mg、4.06 mg、9.48 mg、7.80 mg，分别置6个10 mL的量瓶中；精密称取异迷迭香酸苷4.38 mg置100 mL量瓶中，分别用70 % 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，然后再依次精密量取上述各对照品溶液0.0220 mL、0.9800 mL、0.2430 mL、0.1133 mL、0.1300 mL、0.2300 mL置同一5 mL量瓶中，精密量取异迷迭香酸苷对照品溶液3.62 mL置另一5 mL量瓶中，分别用70 % 甲醇稀释至刻度，摇匀，即得含咖啡酸、异迷迭香酸苷、野黄芩苷、迷迭香酸、黄芩素-7-甲醚、香荆芥酚、麝香草酚浓度分别为2.01 μg/mL、31.71 μg/mL、39.98 μg/mL、53.65 μg/mL、9.20 μg/mL、24.65 μg/mL、46.94 μg/mL的混合对照品溶液。

表1 14批江香薷饮片信息

2.1.2 供试品溶液的制备 取过2号筛的饮片基准(饮片编号S5)粉末约0.5 g，精密称定，置于具塞的锥形瓶中，精密加入90 % 甲醇50 mL ，称定其重量，加热回流提取1 小时，冷却至室温，再称定其重量，用90 % 甲醇补足失重，摇匀，滤过，用 0.45 μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 色谱检测条件 通过自建的色谱检测条件：Waters XBridge Shield RP18色谱柱( 4.6 mm×250 mm，5 μm) ，流动相为乙腈-0.2 % 磷酸水，梯度洗脱，梯度洗脱条件见表2，流速 0.8 mL/min，柱温30 ℃，检测波长270 nm，进样量20 μL；在此色谱条件下，江香薷混合对照品及供试品溶液的HPLC 图谱见图1。

表2 HPLC 梯度洗脱条件

如图所示，15个特征峰分离度良好，通过与咖啡酸、异迷迭香酸苷、野黄芩苷、迷迭香酸、黄芩素-7-甲醚、香荆芥酚、麝香草酚各对照品紫外吸收光谱对比，判断15个特征峰对应的化学成分类型，涵盖了酚酸类、黄酮类、萜类3种主要化学成分类型。

2.1.4有效基准特征图谱方法学考察 (1)精密度考察：精密吸取同一供试品溶液20 μL，按2.1.3项下色谱检测条件，连续进样6次检测，以黄芩素-7-甲醚为参照，计算各色谱峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示：各特征峰相对保留时间的RSD 均<1.49 % ，各特征峰相对峰面积的RSD均<2.78 % ，表明仪器精密度良好，符合特征图谱要求(≤3%)[27]。(2)稳定性考察: 精密吸取同一供试品溶液20 μL，按2.1.3项下色谱检测条件，于0小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24 小时分别进样检测，以黄芩素-7-甲醚为参照，计算各色谱峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示：各特征峰相对保留时间的RSD均<2.34 % ，各特征峰相对峰面积的 RSD均<2.60 %，说明样品溶液在24小时内稳定(≤3%)[27]。(3)重复性考察：取同一批(S5)江香薷饮片，按2.1.2项下方法平行制备 6 份供试品溶液，按2.1.3项下色谱检测条件分别进样检测，计算各色谱峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示：各特征峰相对保留时间的RSD均<2.25 % ，各特征峰相对峰面积的RSD均<2.04 %，说明本方法重复性良好(≤3%)[27]。

A:供试品 ( 270 nm) ; B: 混合对照品 ( 270 nm)

2.1.5 特征代表性成分含量测定方法学考察 (1)线性关系考察：按2.1.3项下色谱检测条件，精密吸取混合对照品溶液，分别设置进样量5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL、35 μL、40 μL进样检测，以进样量(μg) 为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数，结果见表 3。

表3 7个特征代表性成分的线性关系考察结果 (n=8)

(2)精密度考察：精密吸取同一供试品溶液20 μL，按2.1.3项下色谱检测条件，连续进样6次，计算咖啡酸、异迷迭香酸苷、野黄芩苷、迷迭香酸、黄芩素-7-甲醚、香荆芥酚、麝香草酚峰面积的RSD分别为 2.70%、 2.37%、0.35%、1.19%、1.29%、1.41%、2.21%，表明仪器精密度良好，符合含量测定要求(<5%)[27]。(3)稳定性考察：精密吸取同一供试品溶液20 μL，按2.1.3项下色谱检测条件，于0小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时分别进样检测，计算咖啡酸、异迷迭香酸苷、野黄芩苷、迷迭香酸、黄芩素-7-甲醚、香荆芥酚、麝香草酚峰面积的RSD分别为1.15%、2.80%、1.67%、2.23%、1.87%、1.97%、1.25%，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。(4)重复性考察：取同一批(S5)江香薷饮片，按2.1.2项下方法平行制备 6 份供试品溶液，按2.1.3项下色谱检测条件分别进样检测，结果显示：咖啡酸、异迷迭香酸苷、野黄芩苷、迷迭香酸、黄芩素-7-甲醚、香荆芥酚、麝香草酚的平均含量分别为 0.02%、0.33%、0.40%、0.62%、0.11%、 0.20%、 0.37%，RSD值分别为2.04%、1.62%、1.20%、0.73%、0.59%、0.99%、1.14%，表明本方法重复性良好。(5)加样回收率考察：取已知特征指标性成分含量的过二号筛的江香薷饮片(S5)约 0.25 g，精密称定 6 份，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.3项下色谱检测条件分别进样测定，计算得咖啡酸、异迷迭香酸苷、野黄芩苷、迷迭香酸、黄芩素-7-甲醚、香荆芥酚、麝香草酚平均加样回收率分别为98.92%、101.59%、102.31%、99.82%、99.97%、100.75%、99.90%，RSD分别为2.28%、2.47%、2.19%、1.64%、1.65%、2.24%、2.85%，符合定量要求，说明本方法准确可靠，结果见表4。

2.1.6 模拟基准点质量表征考察 文献报道黄酮类成分具有扩张血管、促进血液循环的作用[1,28]，因此以黄酮类有效特征代表性成分黄芩素-7-甲醚作为质量表征基准点。精密称取黄芩素-7-甲醚对照品2.30 mg于20 mL容量瓶中，用90% 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密移取1 mL至10 mL容量瓶中，用90% 甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.0115 mg/mL的黄芩素-7-甲醚对照品溶液作为模拟基准点，即与2.1.2项下制备江香薷饮片(S5)供试品溶液中所检测的黄芩素-7-甲醚含量相同，按2.1.3项下色谱检测条件，得模拟基准点的HPLC色谱图，见图2。

由模拟基准点色谱图可得其保留时间：61.020分钟，峰面积：937319 ，与江香薷有效基准特征图谱中黄芩素-7-甲醚的保留时间(61.012 分钟)、峰面积(891286 )基本吻合，表明所建立的检测方法及其检测结果与模拟江香薷质量表征基准点均具有准确性，即0.0115 mg/mL黄芩素-7-甲醚对照品溶液可作为模拟基准点。

2.2 有效基准特征图谱质量表征信息

以确定有活血药效的江香薷饮片(S5)作为有效饮片(基准)，在其有效基准特征图谱中，共指认出了 15 个特征峰，其中酚酸类特征峰 10 个，黄酮类特征峰 3 个，挥发油中萜类特征峰2个；有效基准特征图谱中15个特征峰的保留时间、峰面积(均以100 mg饮片量计)、含量，以模拟基准点为基准得到的相对保留时间、相对峰面积、相对含量、换算系数(特征代表性成分的相对含量/特征代表性成分的相对峰面积)，见表5。

表4 加样回收率考察结果 (n=2)

图2 模拟基准点的 HPLC 色谱图(270nm)

表5 江香薷有效基准特征图谱质量表征信息

由表5可得，以对照品模拟基准点为基准得到的15个特征峰的相对保留时间、相对峰面积及7个特征指标性成分的相对含量、含量换算系数，即为江香薷有效质量基准标尺。

2.3 应用与验证

取 13 批待评价江香薷饮片，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.3项下色谱检测条件进样检测，得到 13 批待评价江香薷饮片质量表征信息，同时实测江香薷饮片S5(基准)有效基准特征图谱，以及实测13批待评价江香薷饮片特征指标性成分含量，以验证基于质量标尺进行江香薷质量评价的准确性，如图3、4、5、6及表6所示。

如图3、4所示，13批江香薷饮片特征图谱皆含有与有效饮片(S5)基准15个相同的特征峰，且15个特征峰相对保留时间与基准标尺基本一致，同时也与实测值相吻合，表明13批饮片皆为江香薷饮片，且验证了应用基准标尺辨别江香薷饮片真伪的准确性。结果表明：江香薷质量评价标尺中质的标尺具有可行性，可依据其判断江香薷饮片的真伪及对江香薷特征图谱中各特征峰进行指认。

由图5、6可见13批江香薷饮片质量表征信息，可依据其特征峰相对峰面积及相对含量高于其基准标尺对应点的数目、幅度和所涵盖的3种主要化学类型及其黄芩素-7-甲醚同类成分，可对江香薷饮片的质量优劣进行评价；在所研究的14批江香薷饮片中，综合考量评价得出编号S13饮片质量较优，其次是编号S3、S8、S2、S1、S10、S12饮片。

由表6可见，换算含量与实测含量基本一致，即验证了代表性成分换算含量结果的准确性及其相对含量结果的准确性。结果表明：江香薷质量评价标尺中量的标尺具有可行性，可依据其判断江香薷饮片的质量优劣。

注：1-4、6-9: 酚酸类; 5: 咖啡酸; 9: 异迷迭香酸苷; 10: 野黄芩苷;11: 黄酮类 12: 迷迭香酸; 13: 黄芩素-7-甲醚; 14: 香荆芥酚;15: 麝香草酚

图4 13批江香薷饮片与基准(S5)相对保留时间

图5 13批江香薷饮片与基准(S5)相对峰面积

图6 13批江香薷饮片与基准(S5)相对含量

表6 14批江香薷饮片中7个特征指标性成分含量考察结果 (%，n=2)

3 讨论

本文报道研究建立的江香薷有效基准特征图谱质量表征模式、方法，所关注的江香薷饮片中15个特征峰涵盖了其药学架构组成的酚酸类、黄酮类、萜类三种主要化学类型，其中酚酸类成分中咖啡酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸及黄酮类成分中野黄芩苷具有抗血小板聚集、抗血栓作用[29-31]，黄芩素-7-甲醚及2个挥发油中萜类成分香荆芥酚、麝香草酚有扩张血管、降低血液稠度、促进血液循环等作用[1,28,32]，从而整体的反映了江香薷饮片发挥活血药效的有效物质基础；基于此，对14批江香薷饮片进行了质量优良度评价，得出编号S13饮片质量较优，其次是编号S3、S8、S2、S1、S10、S12饮片。建立的江香薷有效基准特征图谱质量表征模式、方法，可简易、准确、整体地对江香薷饮片进行质量表征，并可应用于精准、有效的评价江香薷饮片质量，构建的江香薷质量评价模式关注了饮片质量的精确性与应用有效性，从而为江香薷饮片的精准质量评价与筛选提供了科学依据，亦为其他中药质量表征与评价提供借鉴。

本研究收集了除江香薷饮片S5(饮片基准)外的13批江香薷饮片，结果发现来自不同产地的饮片质量差异性不显著，由于实验采集样品数量只有14批，且只收集了三个产地的江香薷饮片，不能得出有效的统计结论。但在江香薷饮片质量不一的现状下，可关注多种特征成分的类型、含量、峰面积及江香薷有效质量基准标尺，以全面客观评价江香薷饮片的质量，从而完善其质量标准。