夹脊电针通过PTEN通路对脊髓损伤自噬的影响

李竹馨,尹洪娜,李海燕,李晨阳,王雪,孙忠人*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是一种复杂且具有破坏性的疾病，其特征是下行、上行和内在脊髓传导中断[1]，导致慢性神经功能缺失，损伤平面以下出现运动功能丧失，感觉受损，严重损伤自主神经系统。据估计，每年全球SCI的发病率在25万～50万人之间[2]，患者往往在最具生产力的时期残疾，这对个人和社会都有巨大的身体、情感和经济负担。大量研究表明夹脊电针产生的脉冲电场对SCI修复具有促进作用，包括减轻继发性损伤和促进神经修复与再生[3-4]。

自噬是一种具有神经保护特性的溶酶体依赖的细胞降解途径，越来越多的证据表明，在SCI中自噬可以起到中枢神经损伤后的神经保护作用[5-6]。自噬体的出现标志着自噬进程开始，自噬相关基因微管相关蛋白轻链3(LC3)在细胞内以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式出现，自噬形成时，胞浆型LC3(即LC3-Ⅰ)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-Ⅱ)，因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的动态变化可评估自噬水平的高低。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)参与自噬体的诱导及形成，在自噬起始阶段对细胞自噬起负调控作用。作为自噬经典通路PI3K/AKT/mTOR的上游蛋白，磷酸酯酶与同源张力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN)异常表达与自噬相关[7]，是一种有前景的SCI治疗靶点，越来越多的研究表明PTEN在自噬介导的神经细胞损伤后修复起到重要作用[7-9]。PTEN特异性抑制剂bpV(HOpic)主要应用于神经系统疾病的研究。信号转导子和转录激活子3(singnal transducers and activators of transcription 3, STAT3)是调控神经发育的重要转录因子，在创伤、炎症或缺血导致永久性轴突损伤的神经疾病中诱导STAT3持续表达，有助于改善神经功能恢复[10]。本研究涉及的主要路径叙述如图1。

图1 PTEN/mTOR/STAT3通路示意图

那么夹脊电针治疗SCI是否通过影响自噬上下游分子起到治疗作用呢？本研究观察抑制PTEN后，夹脊电针对SCI大鼠运动功能和脊髓组织中LC3-Ⅱ/Ⅰ、mTOR和STAT3含量的影响，阐述夹脊电针对PTEN/mTOR/STAT3通路和自噬的影响，以期为夹脊电针治疗SCI提供一定的实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠120只，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK(黑)2013-012，体质量180～220 g。实验动物饲养于黑龙江中医药大学针灸临床神经生物学重点实验室动物房，室温(25±3)℃，湿度(55±5)%，保持12 h/12 h昼夜循环，给予标准饮食、自由饮水，适应性饲养1周后开始实验。

1.2 实验主要仪器和试剂

NYUImpactor M-Ⅲ型脊髓打击器(美国)；手术器械(上海元洪医疗器械有限公司)；KWD 808Ⅱ电麻仪(中国长城)；0.25 mm×13 mm针灸针(吴江市云龙医疗器械有限公司)；抑制剂bpV(HOpic)(美国Med Chem Express)；Nano Quant infinite M200PRO多功能酶标仪(瑞士TECAN)；大鼠LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、mTOR、STAT3 ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司)。

1.3 造模与干预方法

1.3.1 分组与造模

采用随机数字表法，将大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、电针(EA)组、bpV组和EA+bpV组，每组分为1、3、7、14 d等4个时间点，每组6只。假手术组去除椎板暴露脊髓，但不对脊髓进行打击，模型组、电针组、抑制剂组和抑制剂+电针组在大鼠第10胸椎椎骨平面用打击器以50 g·cm的势能撞击脊髓，以撞击后大鼠出现深长呼吸、摆尾、脊髓血管红肿作为SCI造模成功的标志[11]。

1.3.2 分组治疗

于造模成功后次日开始治疗。抑制剂+电针组每日电针治疗前10 min腹腔注射抑制剂bpV 0.2 mL(200 μL/kg，溶于生理盐水中，-80 ℃冻存)，模型组、假手术组和电针组大鼠腹腔注射0.2 mL生理盐水。电针组方法：将大鼠固定后，在造模时标记处相邻上、下棘突间隙距正中线3～4 mm处进行毫针针刺，针刺深度4～5 mm，电极线以正极在上、负极在下的方式连接同侧穴位。选择连续波(频率为100 Hz)，电流强度约为1 mA，30 min/d，按不同时间点分别连续治疗1、3、7、14 d。疗程完成后分别于次日取材，将损伤组织取出约1 cm长，从横截面正中间剪断，取其中50%冻存于-80 ℃冰箱中待检测。每天进行2次人工挤压膀胱排尿。

1.4 行为学评价

采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分量表[12]对SCI大鼠行走、步态、肢体协调性、脚掌位置和身体稳定性进行综合分析后进行打分。各组大鼠分别于麻醉前、每次治疗前置于开放视野场地自由活动5 min，由两名熟悉此表但对分组未知的研究人员进行交叉评价取均值记录分数。量表范围为0～21分，0分代表完全瘫痪，21分代表运动功能正常。

1.5 ELISA检测法检测脊髓中LC3-Ⅱ/Ⅰ、mTOR和STAT3含量

ELISA试剂盒使用前在常温下平衡20 min，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，样本孔先加待测组织上清液10 μL，再加样本稀释液40 μL。标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100 μL，37 ℃恒温箱温育60 min。洗板，每孔加入底物A、B各50 μL，避光孵育，加入终止液，测定各孔的OD值，计算拟合曲线并换算样本浓度值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 BBB评分情况

见表1和图2。与Sham组比较，其余各组评分均显著降低(P<0.05)。与Model组相比，在1 d时，EA组、bpV组和EA+bpV组评分均无显著性差异(P>0.05)，而在3、7、14 d时差异显著(P<0.05)，说明此时各治疗组开始起到恢复大鼠运动功能的作用。与EA组相比，bpV组在各时间点均无显著性差异(P>0.05)。与EA组和bpV组相比，EA+bpV组在1 d和3 d时无显著性差异(P>0.05)，而在7 d和14 d时评分进显著增高(P<0.05)。

表1 各组BBB评分表比较分)

2.2 脊髓组织LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ含量的比值

见表2和图3。与Sham组相比，Model组各时间点均无显著性差异(P>0.05)。从3 d起，与Model组相比，EA组LC3-Ⅱ/Ⅰ显著升高(P<0.05)。与EA组相比，各时间点的bpV组比值均显著降低(P<0.05)，说明EA较bpV更能引起自噬的发生。与EA组相比，EA+bpV组在7 d和14 d时具有显著性差异(P<0.05)。

图2 各组大鼠BBB评分比较

表2 各组脊髓组织LC3-Ⅱ/Ⅰ比较

图3 各组脊髓组织LC3-Ⅱ/Ⅰ比较

2.3 脊髓组织mTOR含量

见表3和图4。Sham组和Model组在各时间点均无显著性变化(P>0.05)。与Model组比较，EA组在3、7、14 d具有显著性差异(P<0.05)。bpV组与EA组在各时间点均无显著性差异(P>0.05)。与Model组相比，EA+bpV组只在3 d时有显著性差异(P<0.05)。

表3 各组脊髓组织mTOR含量比较

图4 各组脊髓组织mTOR含量比较

2.4 脊髓组织STAT3含量

见表4和图5。1 d时各组均无显著性差异(P>0.05)。3 d时EA组分别与Sham组和Model组比较，均具有显著性差异(P<0.05)。与EA组比较，bpV组和EA+bpV组在3、7、14 d均具有显著性差异(P<0.05)。

表4 各组脊髓组织STAT3含量比较

图5 各组脊髓组织STAT3含量比较

3 讨论

中医认为本病病因为“肾督虚寒”“瘀血留于太阳经中”，因此多以温通督脉法为主，同时重视疏通膀胱经气血，以此进行中药配伍和针灸取穴[13-14]。夹脊穴在督脉与膀胱经之间，同时接受督脉阳气的温煦和膀胱经气血的濡养。而且夹脊穴在后正中线旁开0.5寸胸椎棘突下，深部有脊神经和交感神经，针刺深度达到接近神经根处为最佳[15]。随着交通运输业与建筑业的蓬勃发展，脊髓损伤发病率逐年升高，患者承受着沉重的心理与经济负担。目前临床指南推荐胸腰段脊髓损伤后行手术治疗或佩戴胸腰骶支具8～10周的保守治疗[16-17]。纳米医学和组织工程被认为是很有前途的治疗方法，通过植入或注射生物材料支架来增强轴突生长和方向性，但转化成临床成果需要考虑安全性和巨大的经济投入[18]。电刺激产生的电场与人体的生物电协同作用于脊髓轴突生长，在脊髓损伤部位远端施加电场刺激(EFS)可以延缓和减弱脊髓损伤电位的形成[4]，夹脊电针基于中医辨证论治的理论与实践基础，以针灸针作为电极实现了接近损伤部位的电场刺激，延缓脊髓继发性损伤，改善神经功能，但具体作用机制仍不明确。

本研究首次通过PTEN/mTOR/STAT3信号通路调控的自噬研究夹脊电针的作用机制，发现抑制PTEN后，自噬水平上调。结果显示，在改善大鼠运动功能方面EA组与bpV组水平基本持平，在引起LC3-Ⅱ/Ⅰ变化和mTOR、STAT3含量变化方面EA组与bpV组具有相似的趋势，即在3 d达到高峰，之后呈下降趋势，与SCI损伤后的神经修复时间基本吻合[5],说明EA与bpV均能有效干预SCI后自噬水平。随着治疗时间延长，bpV+EA组的效果虽然没有达到EA组与bpV组的完全叠加效果，但是也体现出了夹脊电针与bpV的协同作用，即总体效果均优于单独EA组与bpV组(P<0.05)。mTOR波动水平虽然不能明确自噬期始的准确情况[16]，但与LC3Ⅱ/Ⅰ相结合可以大致描述自噬的全过程(自噬流)。在今后的研究中将增加进一步检测mTOR磷酸化水平和p62、ATG5等自噬相关基因以求更全面地描述自噬流。

笔者研究初步表明，夹脊电针作为优化自噬的外源性刺激促进脊髓损伤恢复，可能与PTEN抑制剂bpV具有协同作用，能够在通路被激活后上调细胞自噬。PTEN/mTOR/STAT3通路已经在干预癌细胞增殖和避免心肌细胞过度增殖等方面起到显著作用[19-20]，调节神经元内在PTEN/mTOR/STAT3活性是促进成人SCI后突出再生和功能修复的潜在治疗策略[21]，也是目前治疗SCI机制的热点。然而抑制PTEN后对通路其他相关因素如星形胶质细胞、自噬流等方面的影响需要在未来的研究中解决，可以从组织病理形态、蛋白和mRNA含量的动态变化等进一步阐述夹脊电针的作用机制。