高效液相-氢化物发生-原子荧光光谱法分析六神丸在大鼠肝脏中代谢的砷形态

陈吴越，崔欣语，周昊言，王佳佳，周婧，吕翔，马宏跃

(南京中医药大学，江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023)

六神丸作为常用的中成药，由雄黄、冰片、麝香、牛黄、蟾酥和珍珠组成，具有清热解毒、消肿止痛、强心等功效。由于含有雄黄和蟾酥两种有毒中药，加之超剂量使用和错误使用，易导致不良反应的发生，严重影响了六神丸的用药安全性[1]。因此有必要深入了解有毒成分与不良反应之间的关联。六神丸中的雄黄，主要化学组成是As2S2。砷作为有毒的非金属元素，以不同形态广泛地存在于自然界中，主要包括砷酸(AsⅤ)、亚砷酸(AsⅢ)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷胆碱(AsC)等。研究表明，亚砷酸盐、砷酸盐的毒性较大，而有机砷的毒性相对较小[2]。因此在研究砷的药效和毒性时，不仅要测定总砷含量，更要进一步测定砷的化学形态，以了解砷在体内的形态转变及在组织中蓄积的情况。

目前砷形态分析方法主要有高效液相-电感耦合-等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)、高效液相-氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HG-AFS)等。砷形态研究方法主要用于食品、环境、药物、矿物等领域，以研究有毒元素砷的污染、溶出度、毒性和代谢等[3～6]。特别是在中药领域，主要研究非含砷中药材中的砷污染情况、含砷中药及其复方如雄黄、牛黄解毒片、六神丸等的安全性评价及其对癌症等疾病的治疗作用等[7]。目前国内对砷的研究多集中在单味药材雄黄上，而对含砷复方的研究还很少。张庆丽等报道了Beagle犬口服雄黄和六神丸后血液中总砷的毒代动力学情况和曲线峰值点血浆中的砷形态[8]。此外还研究了Beagle犬口服不同剂量的雄黄和六神丸经过28 d服药期和14 d恢复期后，组织中总砷和各形态砷的分布情况[9]。吴倩和王启铮等分别考察了六神丸中可溶性砷的溶出情况，发现六神丸经复方配伍后，能显著降低雄黄中可溶性砷的溶出[10-11]。王启铮等还研究了六神丸和雄黄在大鼠体内的药动学，发现六神丸组大鼠全血中砷的MRT较雄黄组明显缩短，砷更易消除，血浆中总砷浓度更低[12]。应该看到，目前国内关于六神丸中有毒元素砷的系统性研究还比较少，而且在研究中还存在许多问题,如砷元素的提取溶剂的选择；采用高效液相分离不同砷形态时，流动相的种类、pH值和色谱柱等会影响不同形态的分离度；分析方法的局限性会影响到导致某些形态无法测出等。

本研究采用经典的高效液相色谱法，用单根阴离子交换柱等度洗脱，结合原子荧光光谱法建立了大鼠肝组织中砷形态的HPLC-HG-AFS分析方法。从砷形态分析方面探讨了大鼠服用不同剂量的六神丸后，肝组织中各形态砷的分布情况。同时比较了细胞破碎法与超声法两种砷形态提取方法对提取效率的影响，并进行了优化,从而为六神丸用药的安全性和减毒机理提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SA-10型原子荧光形态分析仪(北京吉天仪器有限公司)；配有砷空心阴极灯(HAF-2)；HamiltonPRP-X100色谱柱(250 mm×4.1 mm，10 μm)和HamiltonPRP-X 100保护柱(25 mm×2.3 mm,12～20 μm)；超纯水机；超声机；细胞粉碎机；离心机；制冰机。

砷酸、亚砷酸、一甲基砷、二甲基砷标准溶液(中国计量科学研究院)，磷酸氢二氨、硼氢化钾、氢氧化钠、盐酸、冰乙酸、甲酸均为分析纯，超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

以砷含量计，分别称取一定重量范围内的砷酸根AsV、一甲基砷MMA、二甲基砷DMA、亚砷酸根AsⅢ标准品原液，加超纯水配制成浓度为5、5、10、10 μg/mL的单标。再从中取一定量配成浓度为50 ng/mL的混标母液，稀释获得40、30、20、10、5 ng/mL混标液，-20 ℃保存。临用前涡旋1 min，置于4 ℃。

1.2.2 样品预处理

样本前处理：将给予不同浓度药物的大鼠肝脏液氮研磨，装EP管中，待用。

砷形态提取方法：目前用于砷形态分析的主要提取溶剂分别为水、水-3%乙酸(19∶1)、甲醇-水(1∶1)。水作为提取介质，多应用于脂肪含量较少的物质；若以甲醇-水进行提取，则需要浓缩或氮吹去除甲醇，且过程中易导致三价砷氧化，回收率偏低。水-乙酸法相对简单，操作易行，故选取水-乙酸作为提取溶剂。采用的提取方法为超声法，另外选取细胞破碎法作为对照，并对比两种提取方法对大鼠肝脏中加四种砷形态混标液的提取效率。

超声法：准确称取10 mg肝脏组织加入0.3 mL 200 ng/mL混标，再加入0.7 mL乙酸-水(100∶1)冰浴超声1 h，提取液在 14 000 r/min 下离心10 min，上清置于2 mL离心管中。向组织中再加入0.5 mL乙酸-水，冰浴超声0.5 h，离心混合上清液。重复一次，所有上清液再次离心30 min，过0.22 μm水膜。

细胞破碎法：准确称取10 mg肝脏组织加入0.3 mL 200 ng/mL混标，再加入0.7 mL乙酸-水(100∶1)冰浴细胞粉碎3 min，提取液在 14 000 r/min 下离心10 min，上清置于2 mL离心管中。向组织中再加入0.5 mL乙酸-水，冰浴超声0.5 h，离心混合上清液。重复一次，所有上清液再次离心30 min，过0.22 μm水膜。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的选择

采用HPLC-HG-AFS法测定砷的形态，优化后的检测条件如下：流动相17.5 mmol/L磷酸氢二胺，甲酸调pH=5.9，等度洗脱；还原剂为1.5% KBH4+0.5% KOH；载流为5 %盐酸；屏蔽气流速800 mL/min；载气Ar流速500 mL/min；光电倍增管电压270 V；灯电流为100 mA。

2.2 色谱分离情况

采用HamiltonPRP-X 100色谱柱，在12 min内对四种砷形态的混标液(30 ng/mL)进行等度色谱分离。由图1可见，各物质均达到基线分离，AsⅢ、DMA、MMA、AsV出峰时间分别为2.97、4.01、6.12、11.68 min。AsⅢ的pKa值9.22，在pH=5.9时以H3AsO3形式存在，与离子交换柱无结合，保留时间即为液相的死体积。

图1 四种砷形态色谱图

2.3 标准曲线、检测限和定量限

分别配制了5、10、15、30、40、50 ng/mL,共六种砷形态混合标准溶液，在优化的实验条件下进行分析。结果表明，在5～50 ng/mL范围内，相关系数R2均大于0.99，如表1所示。空跑30 min，对比标准溶液，得出各物质检测限(3倍信噪比)0.46、0.40、0.38、0.69 ng/mL，定量限(10倍信噪比)1.53、1.33、1.27、2.30 ng/mL。

表1 四种砷形态的线性范围、检测限与定量限

2.4 精密度

配制40 ng/mL的4种砷形态混合标准溶液，重复进样3针，测得AsⅢ的RSD为18.42%，DMA的RSD为2.59%，MMA的RSD为5.12%，AsV的RSD为1.34%。

2.5 重复性

取相同量空白样本3份，加相同量的混标液，以超声法进行提取。按前述色谱条件进行测定，得到AsⅢ的RSD为15.03%，DMA的RSD为3.22%，MMA的RSD为4.24%，AsV的RSD为17.93%。结果表明在基质复杂体系中，AsⅢ和AsV的RSD达到了15%。根据2015版《中华人民共和国药典》的规定，在基质复杂、含量低于0.01%及多成分等分析中，重复性可适当放宽[13]。故RSD值仍然在药典可接受的范围内。

2.6 加标回收率

精密称取0.01 g正常组肝脏样品，向其中加入30 ng四种形态砷混合标液，做3份平行样。按上述两种不同方法制备，根据前述色谱条件测定含量，计算回收率。结果发现四种不同形态的砷，超声提取比细胞破碎提取率高，可能与提取时间和温度有关，也可能与砷形态在组织上的吸附有关。按照2015版《中华人民共和国药典》中药品质量标准分析方法验证指导原则，在基质复杂、组分含量低于0.01%及多成分分析中，若待测定成分含量在10 ng/g时，回收率限度可适当放宽[13]。

2.7 大鼠肝脏中砷形态分析结果

采用上述条件对给药六神丸高剂量(给药2个月)、六神丸高剂量(给药1个月)、六神丸低剂量(给药1个月)以及正常组的大鼠肝脏样品进行砷形态分析。结果见表3，六神丸低剂量组大鼠肝组织中砷形态色谱图见图2。数据表明大鼠空白肝组织中含有微量二甲基砷，大鼠灌胃给药后肝脏中主要砷形态化合物也为DMA，但含量明显增大。说明六神丸中的雄黄经配伍后，所含无机砷在大鼠体内转变为有机砷-二甲基砷DMA。在给药剂量一定的条件下，随给药时间延长，DMA含量明显增加，说明长时间给药大鼠肝脏中会产生砷的蓄积。六神丸高剂量组(给药2个月)的DMA含量远远小于DMA的半数致死量(LD50，1 350 mg/kg)，故六神丸中的雄黄不影响其使用的安全性。

表2 两种提取方法对应的四种砷形态的加标回收率

表3 大鼠肝组织中砷形态的测定结果(μg/g)

图2 六神丸低剂量组肝组织中砷形态色谱图

3 结论

本实验以乙酸-水为提取溶剂，采用超声和细胞破碎对大鼠肝脏组织进行处理，离心取上清，重复提取3次，合并上清液，并过水膜。通过HPLC-HG-AFS法测定了大鼠肝组织中砷的形态。结果表明(NH4)2HPO4浓度为17.5 mmol/L、pH为5.89时则能很好分离，且四种不同形态的砷最短在约12 min内可以完整出峰。氢化物发生-原子荧光光谱仪系统中的载气和屏蔽气的流速可以通过影响基峰间接影响峰强度。实验发现载气流速为500 mL/min，屏蔽气为800 mL/min时，出峰状态最佳。最终建立了大鼠肝脏组织中四种砷形态的高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱测定法，实现了四种不同砷形态快速、准确地分离。四种砷形态化合物的线性范围为5～50 ng/mL，相关系数大于0.99，检出限为0.3～0.7 ng/mL，RSD<20%，加样回收率60%～160%。

采用该方法测定了灌胃给予不同剂量六神丸的大鼠肝脏组织中的砷形态，发现肝脏组织中只存在二甲基砷DMA，其他形态的砷未检出。空白肝组织中也含有微量的二甲基砷，给药大鼠肝组织中的二甲基砷含量更高。随着给药时间的延长，肝脏组织中的DMA含量显著增加，说明砷在肝脏组织中产生了蓄积，且蓄积量与时间呈正相关。研究表明了六神丸经肝脏代谢后，原复方中毒性较大的无机砷转变为毒性较低的二甲基砷；六神丸中雄黄不会影响其使用的安全性。