粪肠球菌预测结直肠癌复发的研究

李重 陈飞 王洪伟

结直肠癌是发病率和死亡率位于前列的消化系统恶性肿瘤［1］。化疗是结直肠癌治疗的重要手段，特别是对于晚期结直肠癌患者，化疗能够抑制肿瘤生长，缩小肿瘤体积和抑制肿瘤转移。以氟尿嘧啶和卡培他滨为代表的细胞毒性药物，能够抑制胸苷合成酶的活性，从而抑制DNA复制［2］。奥沙利铂是另外一种常用于治疗结直肠癌的细胞毒性药物。奥沙利铂通过与DNA分子共价结合，形成DNA加合物，抑制肿瘤细胞增殖和诱导G2期阻滞［3］。在结直肠癌治疗中，上述两种药物的联合治疗已经广泛应用。虽然多数患者初始对于奥沙利铂和氟尿嘧啶的反应良好，但是仍然有部分患者最终出现复发。有研究显示，复发的结直肠癌患者5年生存率不足10%［4］。所以，探索结直肠癌患者复发的分子标志物具有重要的临床意义。

肿瘤的复发涉及肿瘤细胞与微环境之间复杂的相互作用。近些年来肠道微生物的研究逐步开展，发现了肠道菌群与结直肠癌的发生与发展密切相关。肠道菌群可以通过影响肠道内的炎症水平和肿瘤细胞生长相关的信号通路，发挥促进肿瘤生长的功能［5-8］。一项利用小鼠模型的研究显示，肠道菌群能够影响肠道黏膜内的免疫状态，从而影响化疗和免疫治疗的效果［9-10］。人类消化道中的菌群也与炎性细胞因子的产生有关［11］。粪肠球菌是一种消化道常见的革兰氏阳性球菌。目前，已经有文献报道，粪肠球菌丰度在结直肠癌中显著高于结直肠息肉患者和健康人群［12］。粪肠球菌能够促进结直肠肿瘤细胞系的增殖［13］，而且可以通过葡萄糖醛酸磷酸转移酶系统加快结肠炎的发展［14］。粪肠球菌感染可能与慢性胰腺炎及肿瘤的发生有一定的关系［15］。由此可见，粪肠球菌在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要的作用。但是，目前粪肠球菌与肿瘤复发之间的关系尚未见报道。

在本研究中，我们通过选取哈尔滨医科大学附属第四医院普外科结直肠癌复发患者与非复发患者的粪便样本。通过16s测序技术，探索肠道菌群与结直肠肿瘤复发的关系。阐述粪肠球菌对结直肠癌复发的临床意义。

材料与方法

一、临床样本的选择

本研究所有的患者及样本均来自于哈尔滨医科大学附属第四医院普外科。自2015年1月至2016年12月，共103例患者经病理诊断为结直肠癌，术前通过胸部及全腹CT排除远处脏器转移。同时收集患者的临床信息及粪便样本。所有患者均接受手术治疗，外科手术后，患者接受标准的XELOX方案化疗，根据RECIST标准诊断共有复发患者39例，非复发患者64例［18］。匹配年龄、性别及肿瘤分期等临床指标后，选择10对复发与非复发患者用于16sRNA测序，其余29例复发患者及54例非复发患者用于PCR验证。本研究方案经过哈尔滨医科大学附属第四医院伦理委员会批准，手术前患者均签署了知情同意书。使用胸部及全腹增强CT及肠镜检测患者术后复发情况，并进行电话随访，随访间隔为3个月，连续随访3年。

二、16s高通量测序

共收集103份粪便样本，DNase酶处理后，经过RNeasy Mini柱分离纯化获得高纯度RNA。分离的RNA样本使用安捷伦2 100 Bioanalyzer进行质量控制。RNA样本在Illumina Hiseq 3000平台进行150 bp的双端测序。RNA测序数据使用TopHat-HTSeq-DeSeq2软件处理［16］。测序读数数据使用TopHatv2.0.11软件比对（humangenome，hg19）［17］。根据Ensembl_GRCh37数据库默认值建立基因名称索引。通过HTSeq包和GTF注释文件，将测序数据文件转化为读数文件。将每个样本的读数文件整理为表达矩阵，用于后续差异表达的筛选。使用DESeq2包筛选差异表达基因，其中读数小于5的基因认为无表达，不予以分析。

三、粪肠球菌检测

根据既往研究的报道，合成检测粪肠球菌所需要的引物。新鲜粪便样本中的基因组DNA通过QIAamp DNA Mini试剂盒提取。每个样本的基因组DNA用于PCR检测粪肠球菌表达量的检测。反应体系配制如下：40 ng的gDNA，10 μL的1×Power SYBR Green PCR混合液，0.4 μM的正向与反向引物置于96孔板中。通过ABI公司7500 Real-Time PCR System扩增检测粪肠球菌的表达。扩增条件如下：95℃10分钟；95℃15秒钟，反复40循环；60℃持续1分钟。粪肠球菌的表达量用Ct值表示。

四、统计学分析方法

所有统计学分析使用R软件完成（www.rproject.org）。所有实验数据至少经过三次独立实验验证，并且以均数±标准差展示。使用单样本的Kolmogorov-Smirnov检验数据是否满足正态分布。如果数据满足正态分布，两组数据之间的比较使用独立样本t检验，多组之间的比较使用单样本方差分析。如果样本不满足正态分布，使用非参数检验，两样本之间的比较使用Mann-Whitney检验。生存数据使用Kaplan-Meier曲线分析。所有统计学分析均为双尾检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

结 果

一、粪便粪肠球菌与结直肠肿瘤患者的复发相关

本研究对10对结直肠肿瘤复发患者和非复发患者粪便样本进行16s测序分析。根据测序数据结果进行主成分分析（principle component analysis，PCA），发现16s数据可以对复发患者和非复发患者进行区分（图1）。对16s测序数据，进行线性判别分析（linear discrimination analysis，LDA），同时筛选得到在复发患者中丰度增高的菌群，如粪肠球菌、具核梭杆菌、脆弱拟杆菌；也筛选得到了在复发患者中丰度降低的菌群，如韦荣氏球菌、窄食单胞菌等；本研究发现粪肠球菌在复发患者粪便中丰度最高，作为后续研究的潜在靶点（图2）。根据我们收集的另外83例样本进行PCR检测，本研究发现在复发的患者粪便中，粪肠球菌的丰度更高（图3）。

图1 10对复发与非复发患者粪便样本PCA分析

图2 16s测序差异表达菌群的LDA分析

图3 83例复发与非复发患者粪肠球菌的表达比较

二、粪肠球菌表达量与患者临床病理特征之间的关系

根据粪肠球菌的相对表达量的中位数，本研究将103例患者分为粪肠球菌高丰度组和低丰度组。通过收集所有患者的临床病例资料，发现在粪便样本中粪肠球菌高丰度患者组在淋巴结转移数目、血管瘤栓、淋巴管瘤栓、神经侵犯这四方面数据更高。而且，还发现该组Ⅲ期患者所占的比例也更高（表1）。

表1 粪肠球菌表达量与患者的一般病理特征关系（例）

三、粪肠球菌与患者的生存密切相关

本研究对103例样本进行生存分析统计，发现粪便中粪肠球菌丰度更高的患者无复发生存时间更短（χ2=5.82，P=0.02）（图4），总生存时间更短（χ2=6.44，P=0.01）（图5）。

图4 无复发生存时间

图5 总生存时间

讨 论

卡培他滨联合奥沙利铂在结直肠癌术后的辅助治疗中取得了一定的疗效［3］。这种联合治疗方案对大部分患者在起始阶段具有一定的疗效，而一部分患者最终会出现复发［19-20］。复发患者对于后续的化疗和免疫治疗均不敏感［21］。因此，探索复发相关的分子标志物，筛选药物治疗敏感的患者，具有潜在的临床意义。

已有研究发现，肿瘤基因组改变和表观遗传改变是肿瘤复发的分子机制［22-24］。最近基于小鼠模型的研究，显示肠道微生物能够调节肠道局部免疫反应，进而影响肿瘤对药物的敏感性［25-26］和免疫治疗的疗效［9-10］。另外基于人群的研究也显示肠道微生物可以通过影响适应性免疫，调节肿瘤对于化疗的敏感性［27］。通过16sRNA测序技术，本研究对复发患者与非复发患者的样本进行分析，发现了粪肠球菌在复发患者的粪便样本中高度富集。既往研究发现，菌群是促进肠癌发展的重要因素。通过宏基因组测序研究发现，具核梭杆菌可以通过结合宿主细胞表面的E-cadherin蛋白，促进肿瘤细胞的增殖［28］。具核梭杆菌同样可以诱导LC3II的表达，促进自噬流和自噬小体的形成，增加了结直肠癌的复发风险［29］。由此可见，肠道菌群在结直肠癌复发过程中发挥重要作用。我们的研究提示了粪肠球菌可能在结直肠癌复发中发挥作用，因此进一步探索粪肠球菌影响肿瘤复发的分子机制，有潜在的应用价值。既往研究还发现，肠道微生物可以作为人类疾病诊断或判断疾病预后的分子标志物。Jiang等［30］报道了拟杆菌，变形菌，放线菌和厚壁菌与人类抑郁情绪相关。在结直肠癌患者中，肠道具核梭杆菌高丰度患者无复发生存时间更长［29］。另外的一项研究报道表明，粪便样本中高丰度具核梭杆菌预测了结直肠癌患者更短的总生存时间［31］。同既往的研究类似，我们的研究也发现了结直肠肿瘤患者粪便中粪肠球菌的含量与结直肠癌患者的复发存在一定联系，粪便中粪肠球菌丰度高者预后更差。粪肠球菌也是与结肠癌相关的细菌，有研究发现了在结直肠癌患者粪便中，粪肠球菌丰度更高［32-33］。肠道中的粪肠球菌能够诱导上皮细胞内的超氧化物形成，进而诱导结肠上皮细胞损伤［34-37］。我们的研究结果也说明了粪肠球菌可能是结直肠癌发展的促进因素之一。与既往研究不同，本研究率先利用复发患者的粪便样本，发现了粪肠球菌可以预测结直肠癌患者术后的复发。既往的研究还揭示了粪肠球菌能够破坏结肠上皮细胞的DNA，激活WNT/β-catenin信号通路，诱导调节多种转录因子的转录活性［37］。

综上所述，本研究显示粪肠球菌与结直肠癌的复发相关。同时发现了高富集粪肠球菌的患者总生存时间和无病生存时间更短。这些研究结果显示了基于粪便样本的粪肠球菌检测具有一定的临床意义，能为结直肠癌复发的早期诊断提供一些新的策略。同时，通过本研究我们有理由相信粪便样本中粪肠球菌丰度可能成为未来判断结直肠癌患者预后新的标志物。