15 份魔芋资源的生物学特性和ISSR 分析

董 坤，陈 玲，卢 俊，张晓玲，郑立飞,4，杨柱琼，余学堂，曾黎琼

（1.云南省农业科学院富源魔芋研究所，云南 富源 655500；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南省农业生物技术重点实验室，农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室，云南 昆明 650223； 3.威信县农业技术推广中心，云南 昭通 657900；4.云南农业大学园林园艺学院，云南 昆明 650201）

魔芋是天南星科多年生草本植物，其球茎中含有大量葡甘露聚糖，该物质具有高吸水性和高膨胀性，在医药、食品、化工等领域都有广泛的应用。中国是魔芋的原产地之一，栽培和利用魔芋历史悠久。云南省特有的地形和气候条件，是发展魔芋产业的适宜 区域[1-2]。尤其是近年来，随着国家乡村振兴战略的实施，魔芋产业成为山区扶贫的重要项目之一，农民种植魔芋的积极性日益高涨。目前，关于魔芋的研究多集中在栽培技术[3-5]、病虫害防治[6-7]等方面。也有学者就魔芋的形态学开展了一系列研究[8-10]，制定了相关的国家标准[11]，为魔芋种质资源的鉴定奠定了良好的基础。在分子标记方面，RAPD、AFLP、ISSR等技术都被应用于魔芋种质资源研究[12-16]，为魔芋属植物分类以及种质资源的遗传多样性分析提供了依据。笔者利用ISSR 分子标记技术，对富源县金地魔芋种业有限公司收集和自育的15 份魔芋资源的亲缘关系进行分析，旨在为不同魔芋资源的鉴定及其开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

15 份魔芋资源编号为1～15 号，其中，1、5～7、11 号来源于云南富源，2 号来源于云南普洱，3 号来源于云南楚雄，4 号来源于云南文山，8 号（远杂1 号）来源于湖北恩施，9、12 号来源于云南临沧，10、13、14、15 号分别来源于云南会泽、贵州威宁、云南昭通、云南泸西。收集后于2019 年种植在富源县金地魔芋种业有限公司魔芋种植基地。

1.2 调查方法

参考NT-T2500—2013 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 魔芋观测记录魔芋植株叶柄、叶片、球茎、花、果的形态特征。播种时测定种芋重量，膨大期测量其株高、叶柄周长、叶柄长度、开展度，倒苗后挖出球茎测定其重量。

1.3 ISSR 分析

采用Magen（美基）生物公司DNA 提取试剂盒提取供试材料单株叶片基因组DNA。DNA 纯化后用0.8%琼脂糖凝胶检测，以确定其质量。利用紫外分光光度计将DNA 浓度调整为10 ng/μL，存于-20℃冰箱备用。

PCR 反应体系总体积为15 μL：天根2×Taq PCR MasterMPCR 7.5 μL，引物（10 μmol/L）1 μL（所用引物由上海生工合成，详见表1），模板DNA（10 ng/μL）2 μL，ddH2O 4.5 μL，最后加1 滴石蜡油防止蒸发。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50～55℃复性30 s（温度因引物不同而异，具体温度如表1 所示），72℃延伸1 min，共35 个循环；72℃延伸10 min。PCR 扩增产物在3%琼脂糖凝胶上以5 V/cm 恒压电泳，选用DL 1 000 marker （宝生物工程大连有限公司）作为对比，通过凝胶成像系统拍照记录。

1.4 数据处理方法

采用Excel 和SPSS19.0 统计软件进行试验数据的分析比较；运用Popgeng-32 软件计算各材料间的遗传相似系数和遗传距离，并进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 魔芋资源的生物学特性

表1 ISSR 引物名称，序列及其退火温度

15 份魔芋资源的形态特征详见图1 和表2。1、3、15、5、13、9 号样品具有花魔芋形态特征，它们的主要区别在于叶柄主色、叶柄斑纹颜色和形状的不同。1、3、15、5、13、9 号样品球茎肉色都为白色，其中15号样品白色球茎肉色中有红丝，与其他样品明显不同。1、3、15、13、9 号魔芋的肉穗状花序长度高于佛焰苞位置；5 号魔芋的肉穗状花序长度约等于佛焰苞位置。6、7、14、8 号样品具有白魔芋形态特征，植株较矮小，主要区别是叶柄主色、叶柄斑纹形状和颜色不同。6 号魔芋叶柄绿色，细小点状灰白色斑纹；7号魔芋叶柄绿色，块状斑纹；14 号魔芋叶柄绿色，点状斑纹；8 号魔芋叶柄浅粉红色，块状墨绿色斑纹。2号魔芋植株相对较大，球茎肉色为黄色，附属器浅紫色且有皱褶，果序为蓝色，鉴定为勐海魔芋。4 号魔芋植株分叉处有株芽，植株较大，球茎肉色为粉红色，佛焰苞内侧红色，外侧粉红色，果序为橙红色，是一种珠芽魔芋。10 号魔芋和11 号魔芋鉴定为滇魔芋，主要区别是叶柄和叶柄斑颜色不同，11 号魔芋的叶柄主色更深，斑点更多，果序为蓝色。12 号魔芋植株较大，丛生性强，球茎上芽点较多，根系发达，球茎肉色为橙色，鉴定为甜魔芋，开花后干枯死亡，未见结子。

图1 15 份魔芋相关器官的形态特征

表2 样品来源及形态比较

2.2 魔芋植株的长势

如表3 所示，2、4 号魔芋的平均株高、叶柄长、开展度、叶柄周长数值较大，6、7、8、14 号魔芋的平均株高、叶柄长、开展度、叶柄周长数值较小；生长系数最大的是5 号魔芋，为5.78。

2.3 ISSR 分析

提取15 份魔芋叶片基因组DNA 进行了ISSR分析。从41 条引物中筛选出31 条引物可扩增出清晰稳定、重复性好、多态性高的条带，图2 为引物UBC822 的电泳图谱。结果显示，以15 份魔芋叶片基因组DNA 作为模板，31 条引物共扩增出490 条DNA带，其中多态性条带共489 条，占99.80%。

利用Popgen 32 软件计算不同魔芋材料间的遗传相似系数和遗传距离，结果见表4。可见，15 份魔芋材料之间的遗传相似系数在0.555 1～0.942 9，遗传距离在0.058 8～0.588 6，其中1 号花魔芋与3 号花魔芋之间的遗传相似系数最大，为0.942 9，遗传距离最小，为0.058 8；3 号花魔芋与11 号滇魔芋芋之间的遗传相似系数最小，为0.555 1，遗传距离最大，为0.588 6。聚类分析结果见图3，15 份魔芋材料在遗传相似系数为0.69 的位置处分成6 大类：第一类包括1、3、15、5、13、9 号样品，具有花魔芋形态特征；第二类包括6、7、14、8 号样品，具有白魔芋形态特征；第三类包括2 号样品（勐海魔芋）；第四类包括4 号样品（珠芽魔芋）；第五类包括10、11 号样品，具有滇魔芋的形态特征；第六类包括12 号样品，具有甜魔芋的形态特征。可见，15 份魔芋的遗传聚类与形态外观调查分析结果基本一致。

表3 15 份魔芋材料的生长情况

图2 ISSR 分析电泳图（引物UBC822）

表4 15 份魔芋材料的的遗传相似系数（—以上）和遗传距离（—以下）

3 小结与讨论

在同样的种植条件下观察不同魔芋种质资源的农艺性状，可以看出曲靖市富源县竹园镇的气候环境不是白魔芋、勐海魔芋、珠芽魔芋、滇磨芋和甜魔芋的最佳生长条件，导致这些魔芋植株长势稍差。从生长系数看，5 号魔芋更适合在当地种植。

图3 15 份魔芋材料的聚类结果

对15 份魔芋材料的叶、球茎、花、果等进行了观察记载和农艺性状分析调查，并利用ISSR 分子标记技术分析了它们的遗传多样性，聚类分析结果显示，花魔芋、白魔芋、勐海魔芋、珠芽魔芋、滇魔芋、甜魔芋各自聚为一类，远杂1 号在遗传上更接近于白魔芋，为今后魔芋种质资源鉴定和保护利用提供了依据。

ISSR 分子标记技术能够揭示植物的遗传多态性，有效反映出品种间的亲缘关系。任盘宇等[14]对云南南部5 种魔芋属植物居群遗传结构的分析中，通过PCR 扩增9 个ISSR 引物共获得95 条条带，其中多态性条带占总条带数的100%。在该研究中，15 份魔芋材料通过31 个引物进行PCR 扩增共获得490 条条带，其中多态性条带489 条，占总条带数的99.80%。遗传相似系数是比较不同品种或群体间遗传多样性的重要指标。任盘宇等[14]利用ISSR 技术对云南南部5 种魔芋属植物居群遗传结构分析的样品间遗传相似系数为0.857 1～0.473 7，宣慢[16]利用ISSR 技术对49 份魔芋属资源的多样性分析，其遗传相似系数为1.00～0.68，该研究中15 份魔芋样品间的遗传相似系数为0.555 1～ 0.942 9，居于前二者的研究结果之间。聚类分析结果显示，花魔芋和白魔芋的杂交品种远杂1 号的亲缘关系更靠近白魔芋。滕彩珠等[17]进行的云南魔芋种质资源亲缘关系ISSR 分析发现甜魔芋与花魔芋聚到一起，与该研究结果中甜魔芋（12 号样品）与滇魔芋（10、11 号样品）聚到一起，有所不同，可能是因为该研究所选择的ISSR 引物较少未能全面地反映二者在DNA水平上的差异所致。