QuEChERS结合GC-MS/MS检测铁皮石斛中5种农药残留

蔡振辉, 张春柳, 许亦峰, 阮碧媛, 郑世仲

(1.宁德市农产品质量安全检验检测中心，福建 宁德 352100；2.宁德市农业农村局，福建 宁德 352100； 3.宁德师范学院生命科学学院，福建 宁德 352100)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKiumra et Migo)属兰科石斛属(Dendrobium)多年生草本植物，广泛分布于我国广西、云南、湖南、浙江等地，以茎入药，具有滋阴清热、益胃生津之功效[1]。现代药理学研究表明，铁皮石斛含有生物碱及多种水溶性多糖、黏液质和微量元素，具有极高的药用价值和显著的防衰老及增强免疫力等功效[2]。近年来，随着铁皮石斛栽培面积的不断扩大，虫害发生率不断提高，继而造成农药滥用。当前，农药残留已经严重影响铁皮石斛质量并引起广泛关注[3]。乙烯菌核利、腐霉利作为常见的杀菌剂广泛用于铁皮石斛灰霉病的防治，毒死蜱、联苯菊酯和伏杀硫磷常用于铁皮石斛中斜纹夜蛾、蚜虫等虫害的防治，因而有必要对铁皮石斛中乙烯菌核利、腐霉利、毒死蜱、联苯菊酯和伏杀硫磷等5种农药残留进行检测[4-5]。

QuEChERS法是当前农药残留前处理技术的首选，主要使用乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine, PSA)、石墨炭黑(graphitized carbon black, GCB)、C18等分散剂进行净化分析，相较传统的固相萃取法具有方便快捷、经济实用等优点[6-8]。气相色谱—串联质谱法(gas chromatography-tandem mass spectrometry, GC-MS/MS)以气相色谱和质谱技术为基础，综合了气相色谱的高效分离能力和质谱技术精密的测定能力，实现对复杂化合物的精确测定[9]。本研究采用GC-MS/MS技术，并结合QuEChERS净化技术建立一种高效便捷的分析方法，检测铁皮石斛中乙烯菌核利、毒死蜱、腐霉利、联苯菊酯和伏杀硫磷等农药残留，以期为铁皮石斛的农药残留检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用铁皮石斛均采购于宁德市蕉城区赤溪镇铁皮石斛种植基地，采购时间为2020年1月下旬。采购的12批次铁皮石斛样品分别来自于4个不同种植户，每个种植户均采购3批次。

1.2 仪器与试剂

日本岛津GCMS-TQ8040气相色谱质谱联用仪，梅特勒PL602E电子天平(梅特勒仪器公司)，超声清洗仪(KQ-500E，昆山舒美)，FP3010料理机(德国Braun公司)，AD500S-H高速均质机(上海昂尼)，Organomation EVAP-111型氮吹仪(美国Organomation公司)，Sigma 3-18KS高速冷冻离心机(德国Sigma公司)，移液器(德国VITILAB公司)。

乙烯菌核利、毒死蜱、腐霉利、联苯菊酯和伏杀硫磷标准样品质量浓度为100 μg·mL-1，购自农业部环境监测保护研究所。PSA、GCB和MgSO4等粉剂及HPLC级乙腈、正己烷和丙酮等试剂购自上海安普公司。

1.3 方法

1.3.1 仪器条件 (1)色谱条件。Aglient DB-5 MS石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；载气：高纯氦气；进样口温度：250 ℃；进样方式：不分流进样；流量控制方式：线速度；进样量：1.0 μL。升温程序如下：初始温度50 ℃保持1 min，以25 ℃·min-1的速率升温至125 ℃，再以10 ℃·min-1的速率升温至290 ℃。

(2)质谱条件：采用EI 离子源，离子源温度200 ℃；接口温度250 ℃；碰撞气为高纯氩气；溶剂延迟3.0 min；采用多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)检测，使用岛津软件系统功能筛选最佳目标离子和参考离子。

1.3.2 分散剂优化 QuEChERS试验中常用的分散剂有无水MgSO4、PSA、GCB和C18等，其中MgSO4主要用于去除水分，PSA可用于去除碳水化合物、脂肪酸、酚类和少量色素，GCB能够去除色素、甾醇类和非极性干扰物，而C18对去除脂肪和酯类等非极性干扰物效果良好[10]。鉴于铁皮石斛鲜条基质组分多为水溶性，油脂量少，故仅选择MgSO4、PSA、GCB作为萃取剂进行优化。通过正交试验L9(3×3)测试PSA、MgSO4和GCB 对铁皮石斛基质的净化效果(表1)，并以5种农药的平均回收率为评价指标，对净化后回收效果进行统计分析。

表1 分散剂正交试验因素和水平设计表1)Table 1 Factors and levels in orthogonal test of dispersants

1.3.3 配置标准曲线溶液 取乙烯菌核利、毒死蜱、腐霉利、联苯菊酯和伏杀硫磷标准样品，通过移液管各吸取1.0 mL标准溶液置于10 mL量瓶中，加丙酮和正己烷混合液定容至刻度，摇匀，配置成10.0 μg·mL-1的中间存储液。配制质量浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 μg·mL-1的标准曲线溶液，加丙酮定容至刻度，摇匀，即得标准曲线系列溶液。

1.3.4 样品处理 使用料理机将铁皮石斛鲜条充分搅碎、混匀，称取10.0 g样品置于50 mL塑料离心管中，随后加入20.0 mL乙腈、5.0 g NaCl、1.0 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠，使用匀质机充分混合后超声提取15 min，随后将离心管置于离心机中5 000 r·min-1离心3 min。离心完毕后吸取5.0 mL上清液分别加入装有700 mg MgSO4、100 mg PSA和10 mg GCB的15 mL离心管中，振荡1 min后5 000 r·min-1离心3 min，准确吸取2.0 mL上清液于10.0 mL试管中，40 ℃水浴中氮气吹至近干。加入1.0 mL体积比为1∶1的丙酮与正己烷混合液复溶，过微孔滤膜用于测定。

2 结果与分析

2.1 GC-MS/MS质谱条件的优化

GC-MS/MS包含农药残留数据库，同时具备质谱系统的优化功能。对混合标准溶液进行全扫描获取了5种农药组分离子碎片和MRM总离子流图(图1)。依据相对丰度、质荷比等因素确定1～3个离子，并将其作为母离子进行产物离子扫描，进一步对离子作用电压进行优化，最终确定最佳子离子和优化电压。经过质谱优化获得5种农药组分的保留时间、MRM离子对及最佳作用电压，结果见表2。

A.乙烯菌核利；B.毒死蜱；C.腐霉利；D.联苯菊酯；E.伏杀硫磷。图1 GC-MS/MS中5种农药标准溶液(1.0 μg·mL-1)的MRM总离子图Figure 1 The MRM chromatogram of 5 pesticide standard solutions (1.0 μg·mL-1) by GC-MS/MS

表2 农药残留化合物的质谱参数Table 2 Mass spectrum parameters of pesticide residues

2.2 QuEChERS中分散剂的优化

表3 3种分散剂组合的正交试验结果1)Table 3 The results of orthogonal tests for 3 dispersants

MgSO4、PSA和GCB等3种分散剂对铁皮石斛的净化效果见表3。从表3可见，各试验组回收率在56.35%～109.40%之间；各分散剂对回收率的影响从大到小依次为：PSA>GCB>MgSO4；PSA、MgSO4和GCB的最佳水平分别为1、3和1，即三者的最佳用量分别为100、700、10 mg。

2.3 方法线性范围、检出限及定量限分析

确定最佳测试条件后，配制系列标准曲线上机测定，以5种农药组分的峰面积(Y)对相应的质量浓度(X)绘制标准曲线。如表4所示，乙烯菌核利、毒死蜱、腐霉利、联苯菊酯和伏杀硫磷质量浓度在0.05～2.0 μg·mL-1的相关系数(r2)均大于0.999，表明其具有良好的线性关系。以3倍信噪比计算检出限(limit of detection, LOD)和以10倍信噪比计算定量限(limit of quantitation, LOQ)表明，LOD在0.001～0.004 mg·kg-1、LOQ在0.003～0.012 mg·kg-1之间，说明该方法具有较好的检出效果。

表4 5种农药残留化合物的GC-MS/MS测定参数Table 4 GC-MS/MS parameters for 5 pesticide residues

2.4 方法的加标回收率与精密度

在空白铁皮石斛样品中加入不同浓度的标准溶液进行加标回收试验。添加标准溶液后制成含量分别为0.2、0.5、2.0 mg·kg-1的测试样品，每种浓度水平设置6组平行。如表5所示，在3种加标水平下，乙烯菌核利等5种农药残留回收率范围为79.76%～91.94%，相对标准偏差(RSD)<5%，表明该方法的回收率与相对标准偏差均符合农药残留检测要求。

表5 加标回收率与精密度的试验结果(n=6)Table 5 Results of recovery and accuracy tests (n=6)

2.5 方法的重复性与稳定性

称取10.0 g铁皮石斛样品6份，加入标准品溶液，设置质量浓度为0.5 μg·mL-1的6组平行，按照“1.3.4”样品制备方法，测试平行样品的进样重复性；另取加标溶液1份分别于室温下放置0、4、8、12、18、24 h后进样分析，检测样品的稳定性(表6)。结果显示，乙烯菌核利等5种农药残留重复性、稳定性RSD分别在1.85%～2.24%和2.78%～4.03%之间，二者均小于5%，表明该方法具有较好的重复性与稳定性，可满足农药残留检测要求。

表6 重复性与稳定性的试验结果(n=6)Table 6 Results of repeatability and stability tests (n=6)

2.6 铁皮石斛样品的测定

根据本研究建立的前处理方法及气质联用仪条件，对赤溪镇12批次铁皮石斛样品进行乙烯菌核利等5种农药残留标准溶液、加标样品和未知样品的检测。根据外标法计算样品中乙烯菌核利等5种农药残留组分的含量表明，12批次铁皮石斛样品均未检出乙烯菌核利等5种农药残留，典型图谱见图2。

A.乙烯菌核利；B.毒死蜱；C.腐霉利；D.联苯菊酯；E.伏杀硫磷。图2 铁皮石斛标准溶液、加标样品溶液和样品溶液的典型图谱Figure 2 Typical spectrum of standard solution, spiked sample solution and sample solution of D.officinale

3 小结

QuEChERS前处理技术相较传统固相萃取技术具有简单快捷、经济高效等特点，并广泛运用于植物农药残留检测[11-13]。本研究通过改善质谱条件和不同分散剂比例，建立了QuEChERS结合GC-MS/MS测定铁皮石斛中5种农药残留的方法，取得了较好的检测效果。对采集的12批次铁皮石斛样品的检测结果均为阴性，表明参试铁皮石斛较好地控制了5种常见农药残留，如需进一步了解食用安全性，仍需增加其他农药的检测。为保证5种农药残留具有最佳的分离效果，研究中气相程序采用较为缓和的升温模式，使得检测时间较长。实际工作中如需大批量进样，可通过加快升温速率或加大载气流量等方式使组分提前出峰以节约时间。