红嘴相思鸟贸易种群性比调查

苏英钰，谢金生，程彬彬，徐永涛，胡晓龙，张微微*，王 丹，2

（1.江西农业大学林学院∕野生动植物与自然保护地研究中心，江西南昌 330045；2.盘锦职业技术学院，辽宁盘锦 124000）

【研究意义】红嘴相思鸟（Leiothrix lutea）是雀形目（Passeriformes）噪鹛科（Leiothrichidae）鸟类[1]。广泛分布于我国南方各省以及越南北部、缅甸西部和北部，并在日本、美国夏威夷群岛以及欧洲中西部有稳定的人工引入种群[2]。红嘴相思鸟叫声婉转悦耳，颜色艳丽，是重要的观赏鸟类[3]。过去红嘴相思鸟的贸易量很大，据统计，仅1991－1995年4年时间合法出口量就在45万只以上，导致资源破坏严重[4]，因此被列入濒危野生动植物种国际贸易公约（CITES）附录Ⅱ，也被列入我国“三有”保护物种名录[5]。其研究主要集中在消化系统[6-7]，神经系统[8]，繁殖生态[9]、寄生虫[10-11]等方面，性比方面研究缺乏报道。性比（sex ratio）是指种群中雄性个体数目和雌性的数目的比例，通常也指雄性个体在群体中的比例[12]，是反映动物种群状况的基本特征参数之一，可分为初级性比（卵性比）和次级性比（雏鸟性比）以及成年性比（Adult Sex Ratio，ASR）。种群水平的成年性比对种群配偶关系及繁殖潜力有很大影响，它决定有效种群的大小，是种群走向繁荣还是没落的一个重要指标[13]。因此，性比是动物种群生态中的重要研究内容，特别是濒危物种。【前人研究进展】了解鸟类种群性比状况，首先要鉴定鸟类性别，其方法主要包括形态学方法、细胞生物学方法（染色体核型分析）和分子生物学方法，但形态学方法与细胞生物学方法对鸟类的伤害性较大[14]，而分子生物学方法更安全可靠，特别是聚合酶链式反应（PCR）扩增法。Ellegren等[15]克隆了第一个定位在鸟类W染色体的基因CHD1-W。由于CHD1基因的高度保守性，所以一对引物可以用于多种非平胸目鸟的性别鉴定；Griffiths等[16]设计了P2∕P8引物可用于绝大多数鸟类的性别鉴定，至今仍广泛应用于鸟类性别鉴定和性比研究[17-19]。利用分子生物学手段对单态型鸟类进行性别鉴定，具有准确性高、简便、成本低且伤害较小等优点[17]。【本研究切入点】红嘴相思鸟属单型性鸟类，雌雄形态差异不显著[20]，但市场上仍采用形态鉴定性别的方法。因此，本研究拟通过分子生物学手段对红嘴相思鸟进行性别鉴定，探讨不同市场上红嘴相思鸟种群性比。【拟解决的关键问题】研究主要通过分子生物学手段对红嘴相思鸟进行性别鉴定，探讨全国范围内不同市场上的红嘴相思鸟种群性比，同时验证市场利用形态鉴定红嘴相思鸟性别的准确率，以此来评估其种群整体性比状况及其贸易捕捉是否存在性别选择，为野生红嘴相思鸟种群的保护和管理提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 血液样本采集

2018年11月—2019年6月，实地调查市场中红嘴相思鸟的贸易现状及部分鸟市基于形态特征的性比状况，并采集红嘴相思鸟血液样本10～20µL用于分子生物学实验。共采集到血液样本361份，采集地分布见表1。

表1 采集地分布表Tab.1 Distribution of collection sites

1.2 分子生物学方法性别鉴定

1.2.1 DNA提取 采用Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒（上海生工）提取样本DNA，4 ℃保存待用。

1.2.2 引物设计及PCR反应条件优化 在通用引物P2∕P8基础上，对扩增片段进行测序，再用获得序列重新设计专一性更高的引物，引物设计在NCBI网站完成。为保证鉴定体系的稳定性，实验中对PCR体系进行不同设定以摸索出最优反应条件。

PCR反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。个体性别判断标准为雄性1条条带，雌性2条条带，每个样本电泳结果3次一致则确定其性别，对于不能成功扩增或结果不一致的个体则舍弃。

1.3 形态学性别鉴定

14个采样组中有7组进行了红嘴相思鸟的形态学性别鉴定，通过询问市场摊主，由其根据经验进行性别判定，即:（1）胸部红色区域更宽者为雄；（2）翅膀上黄色斑块更大为雄；（3）具黄色眼纹为雄等。

1.4 数据分析

以分子生物学鉴定性别的结果为标准，计算市场上形态学鉴定方法的准确率（A），雄性鉴定准确率（AM）和雌性鉴定准确率（AF）[21]，并计算红嘴相思鸟贸易种群的实际性比（R）。

式中，NM、NF、NT分别为雄性鉴定正确个数、雌性鉴定正确个数和样本总数，NM0，NF0分别为用于性别鉴定的雄性个体数和雌性个体数。NM1和NT1分别为分子生物学成功鉴定的雄性个数和样本总数。

所有数据均在Excel2013及SPSS19.0软件中进行处理。

2 结果与分析

2.1 性别鉴定引物及其效果

对原P2引物序列进行了改进，获得了新引物A1，引物序列见表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequence

PCR扩增的反应体系为10 µL，含2×GoTaq®Green Master Mix 5µL，Nuclease-Free Water 3 µL，上下游引物各0.5µL，DNA模板1µL；PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，退火温度1 min，循环35次，72 ℃延伸10 min，A1∕P8退火温度（51±1）℃。

利用A1∕P8引物对红嘴相思鸟性别进行分子生物学鉴定，结果与P2∕P8引物的鉴定结果一致，但A1∕P8引物PCR扩增条带更清晰、稳定（图1）。

图1 不同引物的扩增结果比较Fig.1 Comparison of amplification results of different primers

2.2 性比结果

利用新的引物成功鉴定出361份样本的性别，成功率100%。其中雄鸟163只，雌鸟199只。整体性比为0.45，偏雌。在14个采样组中有5组性比偏雄，7组性比偏雌，2组性比基本平衡（表3，图2）。

2.3 分子鉴定与形态学鉴定比较

7个采样组的红嘴相思鸟形态学性别鉴定结果为雄性114只，雌性65只。由表3可知，形态性别鉴定的总准确率为0.79，其中雄性准确率为0.82，高于雌性（0.74）；7个采样组的性别鉴定准确率不同，仅有1组准确率达到100%。

表3 分子生物学性别鉴定结果Tab.3 Results of sex identification in molecular biology

图2 不同采集点红嘴相思鸟性比结果Fig.2 Sex ratio of Leiothrix lutea collected from different sites

表4 形态学性别鉴定准确率Tab.4 Accuracy rate of morphological sex identification

3 讨论

红嘴相思鸟雌雄在形态上的差别很难通过肉眼进行有效分辨[22]。尽管市场认为不同性别红嘴相思鸟在形态上存在差异，但这些差别的可靠性没有经过科学验证。有研究采用比色法来检验红嘴相思鸟雌雄的体色差异，结果显示众多测量参数中没有任何形态学参数证明在雌雄间存在显著差异，采用单一形态参数预测雌雄的结果准确率很低[23]。本文在验证形态性别鉴定法的准确率时，同样发现其准确率达不到100%，个别鸟市不足50%，说明形态学鉴定方法严重依赖于鉴定者的经验，存在不确定性和显著的个体差异，且对雌性的误判率更高。因此，采用分子生物学方法对红嘴相思鸟进行性别鉴定仍然是最可靠的方法。本文利用引物A1∕P8进行分子生物学性别鉴定，鉴定结果准确，扩增条带清晰、稳定，优于通用引物，可以应用于红嘴相思鸟及其近源物种的性别鉴定。

成年性比呈雄性偏倚现象在许多鸟类中已被证明是普遍存在的，特别是在受威胁的物种和小的或分散的种群中[24-28]。Emilio等[23]在西班牙东北部的巴塞罗那采用陷阱法和雾网法分别在不同地点捕捉了57只红嘴相思鸟，其中33只为雄鸟，24只为雌鸟，性比为0.579，略偏雄。本研究中红嘴相思鸟整体成年性比略偏雌，与Emilio等的结果相反。但不同市场上的性比结果差异很大，例如南昌、合肥和梧州等鸟市的性比结果严重偏雌，西安和成都等鸟市性比结果则严重偏雄。

宠物鸟常常因雄鸟颜色更为艳丽，叫声更为悦耳，导致价格更高，有可能会诱使捕鸟人偏好捕捉雄鸟。经市场调查结果统计，部分市场雄性红嘴相思鸟价格更高，且数量更多。因此，部分市场上红嘴相思鸟性比偏雄的原因可能与非法捕捉中的性别筛选有关，但该理由不能解释雌鸟更多的市场结果；实际上，红嘴相思鸟雌雄差异整体不显著，多数市场上红嘴相思鸟的价格也没有雌雄差异，所以由选择偏好导致的捕捉上的性比偏倚应不是普遍现象。考虑到红嘴相思鸟的捕捉上市时间以秋季为主，此时红嘴相思鸟常成群活动，采用网捕法很难筛选性别，因此，市场上红嘴相思鸟的性比结果可以反映野外种群的实际情况，即很可能存在地区性性比偏倚现象。红嘴相思鸟为留鸟，但季节性集群垂直迁移明显[3,29]，诱引众多捕鸟人前往其活动点张网捕捉，且捕获数量大[2]，网捕个体来自同一群体的概率大，推测单次购买的鸟有很高概率是来自同一地区。从每个市场的统计结果来看，大部分存在性比上的显著差异，仅2个采集地性比平衡。因此，推测红嘴相思鸟不同地理群体的成年性比存在差异，其中个别地理种群性比偏倚可能较为严重。

成年性比（ASR）会影响个体的繁殖或社会地位，以及终生的繁殖成功[30]，且会对种群数量产生深远影响。然而在多数物种的保护当中成年性比没有得到足够的重视。红嘴相思鸟作为我国重要的观赏鸟类，滥捕滥猎情形仍然严重，其野外资源亟需保护。本研究结果是红嘴相思鸟贸易种群成年性比的情况，虽然会受无法排除的人为因素影响（例如多来源、人工筛选等），仍可一定程度上反映出野外群体性比的实际状况及贸易对种群性比的影响，但仍需野外种群调查结果的验证。

致谢：中国科学院动物所雷富民研究员、宋刚副研究员、贵州大学粟海军教授、陕西动物所罗磊副研究员、刘涛、塔旗等在样品采集中提供了帮助，谨致谢意！