粘红酵母降解酚酸自毒物质效能及在西瓜根部定殖研究

王桂莲,李 敏,2,王 静

(1.北方民族大学 生物科学与工程学院,宁夏 银川 750021;2.北方民族大学 宁夏葡萄与葡萄酒技术创新中心,宁夏 银川 750021)

近年来,由化感自毒作用诱发的连作障碍成因及治理是农业科学领域研究的热点问题之一[1-2].化感自毒作用指作物向周围环境(主要是土壤介质)释放出化学物质,该类化学物质的累积会对同茬或下茬作物的生长产生负面影响[3].对西瓜多年连作土壤进行研究发现,阿魏酸、香豆酸、香草酸等酚酸类物质是存在于根系土壤中的主要自毒物质[4-7].酚酸是一类苯环上带有活性羧酸基团的小分子有机酸,在植物体内可通过莽草酸途径合成[8].自然条件下,该类物质通过雨露淋溶,根系分泌和残体腐解等形式进入周围环境,积累到一定量时即对植物产生显著的化感自毒作用.

在自毒物质的防治领域与轮作、嫁接和增施有机肥等措施相比,向土壤中添加有益微生物降解赋存于作物根系的自毒物质,是一种更为彻底有效的防治措施.其中,获得能够在作物根系定殖的酚酸类物质高效降解菌株是关键的技术环节之一.本文以粘红酵母(Rhodotorula glutinis)为生物材料,研究其对西瓜根系主要自毒物质阿魏酸、p-香豆酸、香草酸和丁香酸的降解效能,并探明该菌在西瓜根部的定殖能力,以期为该菌进一步应用于酚酸类自毒物质的防治奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

阿魏酸、香豆酸、香酸草、丁香酸、利福平、二甲基亚砜等药品购自阿拉丁试剂(上海)有限公司,均为分析纯(≥98%).氯化汞(上海广诺化学科技有限公司).色谱分析用甲醇为色谱纯(Sigma-Aldrich);超纯水(电阻率大于18 MΩ·cm)由实验室纯水仪制备.

西瓜种子(金城5号)为宁夏中卫香山硒砂瓜主要栽培品种.

粘红酵母A3为本实验室保存菌种.

1.2 降解效能定量测定

将甘油冻存菌株接种至Luria-Bertani(LB)液体培养基,30 ℃,150 r/min培养至对数生长期后,取一定体积菌液离心,弃去上清液后用无菌水制备成菌悬液.将菌悬液加入含50 mg/L酚酸的降解培养基(培养基配置参照文献[9]),使培养基中菌细胞初始浓度达到108CFU/mL,于150 r/min恒温摇床中振荡培养,定时取样测定培养基中菌细胞数量和酚酸浓度.菌细胞数量采用紫外-可见分光光度计680 nm处的吸光度值定量表征.酚酸化合物定量分析采用高效液相色谱仪(Agilent 1200)串联二极管阵列检测器(DAD,G1315B),色谱柱为Agilent ZORBAX RX-C18、4.6×150 mm、5μm;液相色谱条件为：流动相为甲醇-0.1%乙酸溶液(50/50,v/v),流速 0.5 mL/min,进样量：10 μL;其中,阿魏酸检测波长320 nm,保留时间4.136 min;丁香酸检测波长285 nm;保留时间3.525 min;香草酸检测波长260 nm,保留时间3.559 min;香豆酸检测波长306 nm,保留时间4.046 min.

1.3 A3R在西瓜根系土壤中的定殖

1.3.1 菌株A3的利福平(Rifampicin,以下简称 Rif)抗性标记

采用包含Rif渐进浓度分别为5,10,20,40,60,80,100,200和300 μg·mL-1的LB培养基逐级驯化菌株A3,直至获得能够耐受300 μg·mL-1Rif,且对酚酸类物质降解性能不变的突变菌株A3R.取A3R单菌落,接种于不含Rif的LB培养基,30℃,150 r/min-1恒温振荡培养12 h,取培养液再接种于不含Rif的LB培养基中,相同条件下继续培养,如此重复至96 h后,取100 μL培养液,涂布于无Rif的LB平板上,随机选取100个单菌落转入含300 μg·mL-1Rif的抗生素平板,以抗性菌株所占百分比计算标记菌株A3R的遗传稳定性.

抗性标记菌株A3R的降解效能测定参照1.2中的要求.

1.3.2 标记菌株A3R在土培西瓜根部的的定殖检测

清洗西瓜种子,用无菌水浸泡6 h后,采用0.01 g/L氯化汞溶液处理8 min,再用无菌水漂洗6次,将种子放入无菌培养皿中的湿滤纸床中,在28 ℃黑暗环境培养至种子露白.将露白种子转移至装有灭菌栽培土的育苗盆中,在种子附近施1 mL浓度为1×108cfu/mLA3R菌液,等量无菌水为对照,然后覆盖厚度为1 cm的灭菌栽培土.每个处理3个平行.移至光照培养箱培养,培养条件28 ℃,光周期12 h光照/12 h黑暗.培养7 d后第一次采样,之后每隔4 d取样1次,每次取3株,连续取7次,参照王静[10]方法分别取根际土和根表土测定标记回收菌株A3RC,换算定殖密度.

标记回收菌株A3RC的降解效能测定参照.

2 结果与分析

2.1 菌株A3对酚酸类化合物的降解效能

4种酚酸化合物的分子结构信息如表1所示,菌株A3对它们的降解性能如图1所示.实验结果显示,菌株A3对p-香豆酸、阿魏酸和香草酸表现出较高降解能力,经6～8 h后降解率可达98%以上;而菌株对丁香酸的降解能力最弱,经22 h后体系中仍有50%的丁香酸残留.对比p-香豆酸和阿魏酸的分子结构发现,二者除了苯环3号位取代基不同外,其余结构均一致;其中,前者3号位无取代基,后者3号位有甲氧基取代基,因此推测甲氧基的存在对菌株A3转化利用该类化合物略有阻碍作用.对比阿魏酸和香草酸的分子结构发现,二者除苯环1号位取代基类型不同外,其余结构均一致;其中,前者1号位为丙烯酸基团,后者为羧基,由此推测苯环1号位为丙烯酸基团,有利于菌株A3的降解转化.丁香酸苯环3、4和5号位分别存在甲氧基、羟基和甲氧基,推测上述取代基的存在限制了菌株A3对其的降解效能.综上可知菌株A3对4种化合物降解转化效能的强弱与分子结构特征密切相关.

表1 4种酚酸化合物分子结构信息

图1 菌株A3对酚酸底物的降解活性

2.2 菌株A3在西瓜根部的定殖

2.2.1 标记菌株A3R的筛选

逐步提高Rif浓度,获得能够在300 μg/mLRif LB培养基生长的标记菌株A3R,经不含Rif的LB 液体培养基连续转接8次后涂布于LB培养基,随机挑取100个菌落,发现其均可以在含有300 μg/mL Rif的LB培养基中正常生长,生长情况如图2所示.可见标记菌株A3R的Rif标记稳定性强.

图2 菌株A3R在含有300 μg/mLRif的LB平板上的生长情况

2.2.2 标记菌株A3R在西瓜根部的定殖能力

图3 菌株A3R在西瓜根系土壤中的定殖动态

经A3R菌液浇灌西瓜种子,培养7 d后开始采样测定标记菌株A3R在西瓜幼苗根际土和根表土中的含量,结果如图3所示.第一次取样(7 d)标记菌株A3R在根际土和根表土中的含量均达到最高,分别达 1.32×105cfu/g和2.94×104cfu/g;在培养7 d～19 d内,菌密度呈明显下降趋势;19 d后,菌体密度逐渐趋于稳定,分别维持在2.26×104cfu/g和7.04×103cfu/g左右.将从根际土和根表土中回收的菌株标记为A3RC,验证回收菌株对酚酸化合物的降解性能.

2.2.3 菌株A3RC对酚酸化合物降解性能的验证

考察菌株A3RC对4种酚酸化合物的降解性能,并与菌株A3及A3R进行比对,结果如图4所示.各个降解体系中菌株A3,A3R及A3RC对酚酸的降解能力和菌体的生长状况基本一致.采用统计学方法对各降解体系中酚酸化合物的残留情况进行分析,对于阿魏酸(图4(a))和p-香豆酸(图4(b)),降解4 h后菌株 A3R和A3RC与原菌株A3存在显著性差异(P<0.05),但降解6 h后差异消失;对于丁香酸(图4(d)),降解2、4和6 h菌株 A3R和A3RC与原菌株A3存在显著性差异(P<0.05),但其余组均无差异;总体而言,上述出现差异组的占比很小.可见标记菌株A3R和回收菌株A3RC与原菌株A3对4种酚酸化合物的降解效能一致.

图4 菌株A3,Rif标记菌A3R和西瓜根系土壤定殖回收菌A3RC的遗传稳定性检测

3 讨论

植物根系能够向外分泌糖、氨基酸等多种营养物质,但同时亦能合成并分泌对自身有害的物质,引起化感自毒作用[11-13].已有研究发现假单胞菌(Pseudomonassp.)[14],葡萄球菌(Staphylococcussp.)[15],不动杆菌(Acinetobactersp.)[16],曲霉菌(Aspergillussp.)[17]等对酚酸类化合物表现出高效降解能力,此方面的成果尤以国内学者研究报道居多.Zhang[14]亦发现粘红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)经48 h对1 g/Lp-香豆酸降解效率达70%～99%.但上述研究均聚焦于降解速率的检测,外界环境因素对降解效能的干扰,未能关注到有益微生物在植物根部土壤中大量定殖,是其在自然环境中发挥降解转化自毒物质作用的先决条件.本研究以实验室保存菌株粘红酵母A3为生物材料,研究发现其对p-香豆酸、香草酸、阿魏酸具有高效降解能力,对丁香酸的降解效果较弱.通过抗生素利福平Rif标记菌株A3后进行定殖实验,结果显示施加A3R菌株26 d后,标记菌株A3R在根际土和根表土的定殖密度分别为105和104cfu/g,推测A3R在西瓜根系定殖成功.本研究结果发现粘红酵母菌A3在酚酸类物质积累的连作土壤修复领域具有潜在应用价值,值得进一步研究开发.