丹皮酚对马铃薯块茎蛾雌虫产卵选择及幼虫的忌避作用研究

吴 梅，韩 瑞，周 典，刘 燕，肖 春*

(1. 云南农业大学植物保护学院，昆明 650201；2. 云南中医药大学中药学院，昆明 650500)

马铃薯块茎蛾Phthorimaeaoperculella(Zeller)为鳞翅目Lepidoptera麦蛾科Gelechiidae昆虫，寡食性，主要为害马铃薯、烟草等茄科植物。该虫害在世界各地蔓延迅速，在我国已由云南、贵州等西南地区向西北、华南扩散，且有为害蔓延加重之势，已成为马铃薯主要害虫之一(陆庆光和曹骥, 1983; Trivedi and Rajagopal, 1992; 朱国庆等, 2003; Kwonetal., 2017;徐进等, 2019)。马铃薯块茎蛾的幼虫在田间蛀食马铃薯新鲜植株而导致减产，或是在仓贮期蛀食马铃薯块茎，导致马铃薯不能食用或无法销售而造成巨大的经济损失。马铃薯是主粮亦是蔬菜，在贮藏期间，安全、有效防治马铃薯块茎蛾虫害对保障马铃薯仓贮安全及食用安全十分重要(Upamanyaetal., 2014; Ibrahim, 2015)。

对蛾类害虫综合防治中的“Push-Pull”和“Attract-Kill”策略，是通过行为调控方式控制害虫种群密度，以减轻害虫的发生和为害，这是一种绿色、有效的害虫防治方法(Cooketal., 2007; 陆宴辉等, 2008; Kroschel and Zegarra, 2013)。研究人员通过马铃薯块茎蛾信息素，如性信息素、幼虫虫粪挥发物，或是从其寄主或非寄主挥发物中寻找具有显著引诱或忌避作用的化学物质，阐释调节其行为的化学机制，以期运用于马铃薯块茎蛾虫害综合防治中(Maetal., 2013, 2016; 王春娅等, 2018; Zhangetal., 2019; Lietal., 2020)。

牡丹皮是一味具有芳香气味的常用中药，来源于毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮(国家药典委员会，2015)。牡丹皮在贮存过程中不会发生虫蛀，人们还利用它来保护其它药材，如与泽泻分层存放，可使泽泻免受虫害(王疏梅, 1998)。根据上述现象，推断其挥发物中含有防虫的活性成分，而丹皮酚是牡丹皮挥发物中的主要成分(武子敬和兰兰, 2011)。有关丹皮酚在害虫防治领域的研究报道还很少，夏传国等(1999, 2000)报道了丹皮酚对仓贮害虫药材甲StegobiumpaniceumL.具有熏蒸、触杀及忌避作用；Xuetal. (2003)测试了丹皮酚对家蝇Muscadomestica的胃毒作用；Taketal. (2006)报道了丹皮酚有显著的杀螨虫作用。目前尚无丹皮酚对马铃薯块茎蛾防治作用的相关报道。

本试验通过研究丹皮酚对马铃薯块茎蛾雌虫产卵选择及初孵幼虫、老熟幼虫的忌避作用，为其作为一种有潜力的植物源忌避剂用于马铃薯仓贮期马铃薯块茎蛾虫害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

马铃薯块茎蛾室内饲养方法参考刘燕等(2016)。成虫放入养虫盒中，喂以10%蜂蜜水，盒子顶端开口封24目纱网，上置滤纸，作为产卵场所并便于虫卵的收集。待卵孵化后，将初孵幼虫接种在新鲜马铃薯上(品种为“合作88”)，饲养密度为20头/马铃薯(130±2 g)，将感染幼虫的马铃薯放入事先铺有细沙的养虫笼中，老熟幼虫会从马铃薯中爬出，钻入沙中化蛹，直至成虫羽化。养虫室条件为：27±2℃，RH 50%～70%，L ∶D=14 ∶10。

1.2 实验方法

1.2.1丹皮酚对马铃薯块茎蛾雌虫产卵选择的影响

选择性产卵实验：参考Anforaetal. (2014)、马艳粉等(2016)的方法，并作一些调整。取大小相近的马铃薯(90±10 g/个)备用。将丹皮酚(paeonol，>99%，武汉远程共创科技有限公司)溶解于丙酮中，稀释成系列浓度(5、1、0.2、0.04或0.008 mg/mL)。吸取200 μL丹皮酚溶液滴于滤纸上，室温挥发5 min后，将滤纸放入装有一个马铃薯的玻璃瓶(6 cm×10 cm)中；另一个装有马铃薯的玻璃瓶中则放入只滴加溶剂的滤纸作为对照。玻璃瓶口覆上双层纱布，作为马铃薯块茎蛾的产卵场所，用塑料盖盖上并拧紧(盖子事先沿边缘0.5 cm处去掉顶面)，既可露出纱布，满足瓶内物质的气味通过纱布向外挥发，又可固定纱布。将瓶盖外多余的纱布剪掉，用Parafilm封口。将两个玻璃瓶沿对角线放入长方形容器(36 cm×28 cm×14 cm)中，接入8对已交配成虫(1日龄)，喂以10%蜂蜜水，容器用纱网(24目)覆盖。将容器放入暗室中(26±1℃，RH 50%～70%)，第3天在显微镜下统计纱布上的落卵量，计算选择性产卵忌避指数。每个处理重复5次。

非选择性产卵实验：基本方法同上，在容器中放入2个装有马铃薯以及滴有丹皮酚溶液滤纸的玻璃瓶，另一个容器中则放入2个装有马铃薯以及仅滴有溶剂滤纸的玻璃瓶，作为对照。第 3天在显微镜下统计纱布上的落卵量，同时统计容器壁上的落卵量(吴梅等, 2017)，计算总落卵量及非选择性产卵忌避率。每个处理重复5次。

1.2.2丹皮酚对马铃薯块茎蛾初孵幼虫的忌避作用

参考Wangetal. (2006)的方法，并有一些调整。将丹皮酚溶解于丙酮中，稀释成系列浓度(5、1、0.2、0.04或0.008 mg/mL)。取一张滤纸(φ 7 cm)，用皮带冲在其中心打下圆形滤纸片(φ 1 cm)，再将滤纸裁成两半。将一半滤纸浸入丹皮酚溶液中，另一半则浸入丙酮溶液中作为对照，5 s后取出，室温挥发5 min后，将两半滤纸用双面胶带重新粘合在一起，再将事先打下的圆形滤纸片(φ 1 cm)放回原位。将整张滤纸放在玻璃培养皿(φ 7 cm)中，用一圆环压在滤纸边缘，圆环底边涂抹凡士林以防幼虫爬出。将10头初孵幼虫(<6 h)接在中心圆形滤纸片上，放入暗室中(26±1℃，RH 50%～70%)，10 min后取出，记录处理与对照滤纸上的幼虫数。每个处理重复5次。

为测试丹皮酚对马铃薯块茎蛾初孵幼虫忌避作用的持续时间，根据上述实验结果，选取5 mg/mL丹皮酚溶液作为测试浓度。取一张滤纸(φ 9 cm)，裁去中心直径为6 cm的圆形，剩下部分浸入丹皮酚溶液中，5 s后取出，室温挥发5 min后，放在玻璃培养皿(φ 9 cm)中，再将一张空白滤纸(φ 7 cm)粘在上面。将10头初孵幼虫(<6 h)接在空白滤纸上，放入暗室中(26±1℃，RH 50%～70%)，每隔0.5 h记录仍留在空白滤纸上的幼虫数,并清除已爬出空白滤纸的幼虫，计算幼虫忌避率。每个处理重复5次。

1.2.3丹皮酚对马铃薯块茎蛾老熟幼虫的忌避作用

老熟幼虫从马铃薯中爬出后，喜欢钻入沙中化蛹，筛取当天爬出的老熟幼虫备用。将丹皮酚溶解于丙酮中，稀释成系列浓度(25、5、1、0.2或0.04 mg/mL)。取10 g细沙，滴加200 μL丹皮酚溶液，混匀，细沙中只滴加200 μL丙酮溶液作为对照，室温挥发10 min，将处理组和对照组细沙分别铺在长方形容器(16 cm×11 cm×5.5 cm)的两侧，两侧细沙相距8 cm。具容器底面高1 cm处放一具网孔的塑料板(2 mm)，塑料板中央放一内壁光滑的塑料圆环(2 cm×2 cm)，将10头老熟幼虫接在圆环中，老熟幼虫自行从孔中钻入到容器底部，寻找合适场所化蛹。容器用保鲜膜封口，并用昆虫针在保鲜膜上均匀戳孔。将容器放入暗室中(26±1℃，RH 50%～70%)，24 h后取出，记录两侧沙中幼虫及蛹的数量，处于空白地带的幼虫或蛹视为无效。每个处理重复5次。

1.2.4模拟仓贮实验

模拟仓贮实验参考Anforaetal. (2014)的方法，并有一些调整。实验在体积为7.5 m3的房间(长×宽×高=2.1 m×1.7 m×2.1 m)中进行，条件为：26±1℃，RH 50%～70%，L ∶D=14 ∶10。实验开始前，整个房间经过清洗并通风1周，将通风口及门封以防虫纱网。房间中放3个木箱(32 cm×32 cm×32 cm)，呈三角形摆放，相距约1 m。在一铁丝网中央及四角分别悬挂一张滤纸，将1 g丹皮酚溶解在丙酮中，平均滴加在滤纸上，室温下挥发5 min后，将铁丝网架在木箱中，滤纸在铁丝网下面，距箱底约5 cm。另一个房间同样摆放3个架有铁丝网的木箱，滤纸上仅滴加溶剂作为对照。将18 kg健康马铃薯(90±10 g/个)平均分成6份，分别放在上述6个木箱中的铁丝网上，每箱约3 kg马铃薯(33个)。往房间中接入25对已交配成虫(1日龄)，将门关紧，15 d后检查马铃薯被马铃薯块茎蛾幼虫侵染情况，计算马铃薯受损率。

1.3 统计分析

选择性产卵忌避指数(oviposition deterrent index,ODI)按下列公式计算(Sinthusiri and Soonwera, 2014)：

ODI=落卵量(处理-对照)/落卵量(处理+对照)。ODI范围是-1.0～+1.0，若ODI≤-0.3，表明具有产卵忌避作用，ODI≥+0.3，表明具有产卵引诱作用，ODI=-0.3～+0.3，表明对产卵无影响。

非选择性产卵实验及模拟仓贮实验采用独立样本t检验分析处理与对照组间的显著性差异。非选择性产卵忌避率按下列公式计算(吕朝军等，2015)：非选择性产卵忌避率(%)=落卵量(处理-对照)/落卵量(对照)×100。马铃薯受损率按下列公式计算(Anforaetal., 2014)：

马铃薯受损率(%)=被幼虫侵染的马铃薯个数/马铃薯总个数×100。

采用χ2检验分析丹皮酚对马铃薯块茎蛾初孵幼虫及老熟幼虫行为影响实验中处理与对照组间的显著性差异(Wangetal., 2006)。幼虫忌避率按下列公式计算：

幼虫忌避率(%)=空白滤纸上的幼虫数/总虫量×100。

以上数据均使用SPSS 17.0统计分析软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 丹皮酚对马铃薯块茎蛾雌虫产卵选择的影响

丹皮酚对马铃薯块茎蛾雌虫有显著产卵忌避作用。在选择性产卵实验中，5 mg/mL丹皮酚溶液对马铃薯块茎蛾的产卵忌避指数为-0.63，有显著产卵忌避作用；当浓度降低至1 mg/mL以下，对马铃薯块茎蛾的产卵选择无影响。在非选择性产卵忌避实验中，5 mg/mL丹皮酚溶液处理与对照纱布上的落卵量有极显著差异(t=11.2,P<0.01)；1 mg/mL浓度下，处理与对照纱布上的落卵量仍有极显著差异(t=4.8,P<0.01)；产卵忌避率分别为-89.0%和-46.6%。5 mg/mL丹皮酚溶液处理与对照间总落卵量有极显著差异(t=4.7,P<0.01)，表明丹皮酚对马铃薯块茎蛾产卵有抑制作用。(表1、表2)。

表1 选择性产卵实验中丹皮酚对马铃薯块茎蛾雌虫产卵行为的影响Table 1 Dual-choice oviposition deterrent of paeonol on Phthorimaea operculella

表2 非选择性产卵实验中丹皮酚对马铃薯块茎蛾雌虫产卵行为的影响Table 2 No-choice oviposition deterrent of paeonol on Phthorimaea operculella

2.2 丹皮酚对马铃薯块茎蛾初孵幼虫的忌避作用

丹皮酚对马铃薯块茎蛾初孵幼虫有显著忌避作用。5 mg/mL丹皮酚溶液对马铃薯块茎蛾初孵幼虫有极显著忌避作用(χ2=45.3，P<0.01)；浓度降低至1 mg/mL时，仍保持极显著忌避作用(χ2=34.4，P<0.01)；浓度降低至0.2 mg/mL以下，处理与对照之间未显示出显著差异。5 mg/mL丹皮酚溶液对马铃薯块茎蛾初孵幼虫的忌避作用在0.5 h内可保持100%的忌避率，至1 h，忌避率降低至85%左右，之后忌避作用快速降低，1.5 h时忌避率已降低至50%以下。

图1 丹皮酚对马铃薯块茎蛾初孵幼虫的忌避作用Fig.1 Deterrent effect of paeonol on neogenetic larvae Phthorimaea operculella注：**表示处理与对照之间差异极显著P<0.01(χ2检验)。Note：** indicated significantly different at 0.01 level(P<0.01)between treatment and control(χ2 test).

图2 丹皮酚对马铃薯块茎蛾初孵幼虫的忌避时长Fig.2 Deterrent duration of paeonol on neogenetic larvae Phthorimaea operculella

2.3 丹皮酚对马铃薯块茎蛾老熟幼虫的忌避作用

丹皮酚对马铃薯块茎蛾老熟幼虫有显著忌避作用。丹皮酚 ∶沙(1 mg ∶2 g)浓度下，处理与对照之间有显著差异(χ2=12.8，P<0.05)。浓度降低至丹皮酚 ∶沙(1 mg ∶10 g)以下，处理与对照之间未显示出显著差异。(图3)。

图3 丹皮酚对马铃薯块茎蛾老熟幼虫的忌避作用Fig.3 Deterrent effect of paeonol on mature larvae Phthorimaea operculella注：*表示处理与对照之间差异显著P<0.05(χ2检验)。Note：* indicated significantly different at 0.05 level(P<0.05)between treatment and control(χ2 test).

2.4 模拟仓贮实验

对照组马铃薯的受损率为80.8%，而处理组为23.2%，两者具有极显著差异(t=12.7; df=4;P<0.01)，丹皮酚可有效保护马铃薯免受马铃薯块茎蛾为害(图4)。

图4 模拟仓贮实验马铃薯受损率Fig.4 Percentage of potato tubers damaged by Phthorimaea operculella in the warehouse experiment注：**表示处理与对照之间差异极显著P<0.01(t检验)。Note：** indicated significantly different at 0.01 level(P<0.01)between treatment and control(t test).

3 结论与讨论

植物在与植食性昆虫长期共同进化过程中，形成了以次生代谢产物为主的化学防御体系，其中植物挥发性成分是该体系重要的组成之一(Rajendran and Sriranjini, 2008; Campoloetal., 2018)。非寄主植物释放的挥发性物质往往含有忌避或干扰昆虫行为的化学物质，即使是能被昆虫识别并准确定位的寄主植物挥发物中也可能含有此类物质(Anforaetal., 2014)。马铃薯块茎蛾雌虫选择产卵场所时能根据寄主挥发物区分完整马铃薯和机械损伤的马铃薯，雌虫选择将卵直接产在完整马铃薯上，更有利于幼虫的取食和生存(Arabetal., 2007)。本研究利用纱布作为马铃薯块茎蛾雌虫产卵的场所，消除了触觉、视觉等的干扰因素，测试了丹皮酚蒸汽对其产卵选择的影响，结果表明，丹皮酚对马铃薯块茎蛾产卵有显著忌避作用，而且高浓度丹皮酚对雌虫产卵有抑制作用，这意味着丹皮酚会干扰马铃薯块茎蛾对产卵场所的选择，减少直接产在寄主马铃薯上的卵量，同时减少总产卵量。马铃薯块茎蛾在仓库环境下一年可发生多个世代，存在不同虫态交叠的情况，故本研究同时考察了丹皮酚对马铃薯块茎蛾初孵幼虫及老熟幼虫的忌避作用，结果表明丹皮酚对上述两种虫态均有显著忌避作用。模拟仓贮实验验证了丹皮酚对马铃薯的保护作用，结果表明在丹皮酚蒸汽的保护下，马铃薯的受损率由80.8%降低至23.2%。

应用“Push-Pull”策略防治马铃薯块茎蛾虫害，需要“忌避剂”与“引诱剂”的配合才能更好的发挥防治作用，丹皮酚与已知“引诱剂”的组合研究尚未开展；此外，丹皮酚的忌避作用与其浓度直接相关，植物挥发物具有对哺乳动物毒性低、易降解、残留低等优点，但其应用受到沸点高、蒸气压低等物理性质的限制(Rajendran and Sriranjini, 2008)，如何保持丹皮酚有效的熏蒸浓度及忌避时长？该问题的解决还需今后开展其制剂相关研究。

丹皮酚对马铃薯块茎蛾雌虫产卵选择及幼虫均具有显著忌避作用，是马铃薯仓贮期马铃薯块茎蛾虫害防治的又一有潜力的植物源忌避剂，进一步拓宽了丹皮酚在虫害防治领域的应用。