吡虫啉与环境温度协同作用对意大利蜜蜂的影响

范荣莉，王 康，季文娜，陈孝梅，蔺哲广，吉 挺*

(1. 扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2. 扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009)

意大利蜜蜂Apismelliferaligustica是一种重要的经济昆虫，不仅为人类提供蜂蜜、蜂花粉、蜂胶和蜂王浆等丰富的蜂产品，而且作为农作物授粉的重要媒介昆虫(Pottsetal., 2010)，对农业增产增收和生态系统的稳定具有重要作用(Free 1970; Gallaietal., 2009)。蜜蜂是一种变温动物，体温随着外界环境温度改变而变化。整个蜂群可以被看作特殊的“超个体”，当蜂群内存在子脾时，子脾附近的温度能够维持在34.5℃左右(陈恕仁和曹磊, 2012)。当外界环境温度较低时，蜜蜂通过胸部肌肉震动产热、相互结团等方式提高蜂群的温度。而当外界气温超过35℃，蜜蜂通过扇风、采水降温等方式调节蜂群的温度(赖康等, 2012)。

温度影响蜜蜂卵、幼虫和蛹期的生长发育，甚至能够干扰蜜蜂羽化后的行为表现。意蜂工蜂蛹期在29～37℃均可发育，最适宜温度为35℃，随着温度降低工蜂封盖发育期极显著延长。封盖时的发育期温度低于29℃或者高于37℃会导致意蜂发育畸形，低于28℃或者高于39℃意蜂的封盖子全部死亡(李月, 2008)。最近有研究发现对比35℃，32℃蛹期发育而来的蜜蜂拥有更重的体重和更长的寿命(Szentgyörgyietal., 2018)。蛹期温度能够影响成年蜜蜂脑部蘑菇体内突触复合体的大小和结构，这些变化可能会对蜜蜂神经系统产生影响，进而改变蜜蜂行为(Grohetal., 2004)。Becher等(2009)发现在一定范围内(32～36℃)，蛹期温度越低的蜜蜂首次采集日龄越晚，且在社会分工中更倾向于采蜜任务。有研究发现蛹期发育温度显著影响蜜蜂的短期记忆能力，报道称35～36℃温度环境发育的蜜蜂表现突出的记忆行为，而经历32℃蛹期温度的蜜蜂成年后回巢率降低(Tautzetal., 2003; Jonesetal., 2005)。此外，其他如发育温度对巢内温度的调节行为、采集能力和抗螨梳理行为等研究亦有报道(Siegeetal., 2005; Currie and Tahmasbi 2008; 杨爽等, 2010)。

农药除直接杀死蜜蜂外，会影响蜜蜂的行为、神经、发育、繁殖力、免疫力、学习能力等其他特征(Wuetal., 2017)。新烟碱类农药由于其特殊的结构以及对高等动物低毒等特点使其广泛被使用，吡虫啉就是其中之一(Castleetal., 2010; Jeschkeetal., 2011)。吡虫啉在农业生产上被广泛用于种子、叶面和土壤中多种害虫的防治，对环境的负面影响也逐渐显露(张敏恒等, 2012)。目前关于吡虫啉对蜜蜂的影响研究报道有很多：周婷等(2013)发现吡虫啉除了文献报道的抑制n ACh R的表达外，还能抑制n ACh R-α7的表达量；Daniel等(2014)研究了吡虫啉对非洲蜜蜂头部和胸部线粒体生物能功能的影响，发现吡虫啉可阻断线粒体产能，导致ATP的消耗；代平礼等(2013)、Axel等(2004)用吡虫啉以经口方式对蜜蜂进行处理，发现吡虫啉可损害蜜蜂嗅觉学习能力；吴艳艳等(2014)从细胞水平证实了亚致死剂量吡虫啉对成年意蜂工蜂脑神经细胞具有致凋亡作用。随着农药安全使用指导及风险监控的逐渐加强，由高毒农药引起的蜜蜂急性中毒的现象得以缓解，但农药的亚致死效应带来的一系列潜在的影响也逐渐地引起重视。如亚致死剂量农药处理后导致蜜蜂幼虫孵化率降低，成年工蜂分工行为不明显，采集酿蜜混乱，巢房清理行为也明显减少，导航定位和辨别同群蜜蜂的能力下降，学习记忆能力受到影响等相继被报道(Kreissl and Bicker, 1989; Vandame and Belzunces, 1998; Alixetal., 2001; Yangetal., 2012)。

意蜂工蜂蛹期在29～37℃均可发育，成年工蜂在10～38℃能够正常出箱活动。因此，外界环境温度和农药很可能是蜜蜂物种同时遭遇的两种胁迫。Piotr等(2010)通过实验室内人工饲喂的方式比较不同发育温度蜜蜂对乐果农药的耐药性，结果发现33℃孵化的蜜蜂幼虫对农药更加敏感，半数致死浓度远高于(28倍)其在35℃环境中的浓度。关于温度对蜜蜂生长发育的影响和农药对蜜蜂的影响研究较多，然而，国内外关于羽化后成年蜜蜂暴露的环境温度与农药的协调作用的研究较少。本文以研究较为透彻的吡虫啉农药为例，分析羽化后蜜蜂在不同温度环境受到吡虫啉胁迫后的影响，以期为农药在不同季节使用的安全性评价以及蜜蜂保护提供新的研究角度。

1 材料与方法

1.1 供试蜜蜂

试验蜜蜂来自扬州大学试验蜂场，为本地意大利蜜蜂Apismelliferaligustica。

1.2 供试试剂及主要仪器

吡虫啉原药(97%)来自扬州大学植物保护学院；Trizol试剂、反转录和荧光定量试剂盒来自诺唯赞生物科技有限公司；蛋白浓度定量试剂盒，AchE试剂盒，CarE试剂盒和GST试剂盒均来自索莱宝生物技术有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯。恒温培育箱来自江南宁波仪器制造厂(HWS-328)；全自动酶标仪型号为Biotek synergy2。

1.3 试虫处理

准备3箱群势一致的健康姐妹蜂王群，用稀糖奖励饲喂和蜂王限制器控制蜂王在给定空巢脾上产卵8 h。观察到巢脾上观察到大量卵后将蜂王隔离在限制器外，工蜂可以自由进出哺育幼虫。19 d后，分别从3箱中取出相应巢脾，放到实验室恒温恒湿培养箱内(温度35℃，湿度75%)。待新蜂出房后，立即捉取240头，随机分为2组，每组6笼，每笼20头，分别放入25和35℃培养箱环境中。将分组蜜蜂饥饿5 h后，人工饲喂2 μL下述不同糖饲料。试验重复3次。

1.4 不同温度下吡虫啉胁迫对蜜蜂毒力测定

用丙酮将97%吡虫啉原粉配制成10 000 mg/L的原液，用50%糖水稀释成0、4、7、10、15和20 mg/L浓度梯度。记录24 h急性死亡率，进行不同温度下24 h吡虫啉胁迫对蜜蜂毒力测定。

1.5 免疫基因表达测定

根据毒力曲线计算出25℃环境下吡虫啉胁迫对蜜蜂的LC10为4.032 mg/L。采用1.3中方法，饲喂LC10和4.032 mg/L丙酮对照。24 h后将蜜蜂处死，从不同温度处理的对照和农药胁迫组中各取3头蜜蜂，截取头部组织用于免疫基因表达测定，试验重复3次。使用Trizol法提取总RNA，按照试剂盒(FastQuant RT Kit，天根)说明书操作反转录出cDNA。构建20 μL反应体系：SYBR©Premix Ex TaqTMⅡ酶10 μL，上、下游引物(表1)各0.4 μL，cDNA 0.4 μL，ROX 0.4 μL，无RNA酶水补充至20 μL。反应条件：预变性95℃ 30 s；循环反应(30个)：95℃ 10 s，60℃ 30 s；溶解曲线阶段：60℃升温至95℃。采用2-△△Ct法进行相对表达定量。

表1 基因引物

1.6 解毒酶活性测定

根据毒力曲线计算出25℃环境下吡虫啉胁迫对蜜蜂的LC10为4.032mg/L。采用1.3中方法，饲喂LC10和4 mg/L丙酮对照。24 h后将蜜蜂处死，从不同温度处理的对照和农药胁迫组中各取5头蜜蜂，截取头部组织测定Ache活性，腹部用于测定羧酸酯酶CarE和GST活性，试验重复3次。按照蛋白浓度定量试剂盒，AchE试剂盒，CarE试剂盒和GST试剂盒说明书要求测定蛋白浓度和解毒酶活性。酶活性易受高温影响，采用低温匀浆破碎仪破碎组织。使用Biotek synergy2全自动酶标仪进行自动加样和温度控制，以满足酶活试剂盒需要的温度和精确反应时间的要求。

1.7 数据处理

毒力曲线数据使用软件SPSS中probit分析程序完成，其余采用Duncan氏多重和LSD互作比较进行分析，文中数据均为平均值±标准误，以P<0.05作为差异显著性标准。

2 结果与分析

2.1 不同温度下吡虫啉农药对蜜蜂死亡率的影响

1日龄新出房蜜蜂在25℃和35℃温度环境暴露于吡虫啉农药胁迫的急性毒性回归方程见表2。蜜蜂的死亡率与吡虫啉农药的浓度呈正相关，25℃和35℃环境中吡虫啉对1日龄蜜蜂的急性毒性LC50分别为11.074 mg/L和8.948 mg/L，差异显著(P<0.05)。说明处于相同浓度的吡虫啉毒素胁迫，暴露于35℃的蜜蜂死亡率显著增加(P<0.05)。结果表明，温度可以与吡虫啉农药产生协调作用，对比25℃，35℃环境温度可以加剧农药对蜜蜂的急性死亡胁迫。

表2 吡虫啉对意大利蜜蜂的毒力曲线(24 h)

2.2 不同温度下LC10吡虫啉农药对蜜蜂免疫基因的影响

在本实验选择的温度条件下，对照组的免疫基因没有出现显著的表达差异，表明温度因子不会影响蜜蜂免疫基因的表达。而LC10吡虫啉胁迫能抑制机体内免疫基因Abaecin，Hymenoptaecin，Apidaecin，Defensin1,Defensin 2基因的表达，其中Abaecin和Apidaecin抑制效果显著(P<0.05)。这种趋势在25℃和35℃环境中表现一致，而且35℃环境中下调更为明显，但是不具统计学差异(P>0.05)。结果表明，温度因子可以与吡虫啉农药产生协调作用，对比25℃，35℃环境可能会更大程度的降低蜜蜂免疫能力。

图1 不同温度下LC10吡虫啉对蜜蜂6种免疫相关基因表达的影响 Fig.1 Effects of LC10 imidacloprid on the expression of six immune-related genes in honeybees at different temperatures注：不同小写字母代表差异显著(P<0.05)；图2同。Note：Different small letters above bars represent significant difference (P<0.05)；The same for Fig. 2.

2.3 不同温度下LC10吡虫啉农药对蜜蜂解毒酶和AchE活性的影响

不同处理蜜蜂的解毒酶活性见图2。由图可知，CYP450和CarE经过吡虫啉处理活性均显著提高(P<0.05)，AchE活性出现显著抑制。值得注意的是，蜜蜂在25℃环境受到吡虫啉胁迫后CYP450激活程度最高，显著高于两种空白对照，甚至显著高于其在35℃环境中(P<0.05)。GST活性出现不同程度变化，但不具有统计学意义。

图2 不同温度下LC10吡虫啉对蜜蜂解毒酶和AchE活性的影响Fig. 2 Effects of LC10 imidacloprid on bee detoxifying enzyme and AchE activities at different temperatures注：A，CYP450，细胞色素P450；B，CarE，羧酸酯酶；C，GST，谷胱甘肽s转移酶；D，AchE，乙酰胆碱酯酶.Note：A，CYP450，Cytochrome P450；B，CarE，Carboxylesterase；C，GST，Glutathione-S-transferase；D，AchE，Acetylcholinesterase.

3 结论与讨论

胃毒法是实验室常用的农药安全性评价方法。前期预实验中，采取让蜜蜂自由采食含吡虫啉农药糖水的方式进行农药因子胁迫,结果发现暴露于相同浓度吡虫啉农药的蜜蜂死亡率在各个重复组中差异较大，多次试验发现24 h死亡毒力回归曲线相关系数0.8～0.9之间。因此，采取人工单只口头饲喂的方法进行农药胁迫，使得毒力曲线相关系数提高到0.9以上，增加了试验结果的准确性，并根据25℃毒力曲线确定LC10(4.032 mg/L)剂量浓度进行后续试验分析。

抗菌肽在昆虫先天免疫系统中起到非常重要的作用，是昆虫体液免疫的重要功能物质(Ferrandonetal., 2007)。目前，蜜蜂上已经鉴定到6种免疫效应抗菌肽：常见的Defensin家族基因(Defensin 1和Defensin 2)，富含亮氨酸的Abaecin和Apidaecin蛋白以及蜜蜂物种特有的Hymenoptaecin和Apisimin抗菌肽(Evansetal., 2006)。2006年蜜蜂全基因组测序完成后，发现蜜蜂种群具有的已知免疫基因家族数量较少(Weinstock, 2006)。因此，除了群体社会性防御可以有效地降低病原体的压力外，现存免疫基因强大的多态性可能也是维持蜜蜂健康生长的重要因素，如Apidaecin每个外显子的可变剪切都能编码出一种功能独特的抗菌肽(Casteels-Jossonetal., 1993; Evansetal., 2006)。这些抗菌肽在蜜蜂抵抗外源毒素侵害如病原菌和农药胁迫方面发挥着重要的作用(Danihlíketal., 2015; 施腾飞等, 2017)。本研究发现吡虫啉处理可以显著降低Abaecin和Apidaecin基因的表达。Defensin 1、Defensin 2、Hymenoptaecin和Apisimin基因表达有所降低，但结果差异不显著，在更高的温度(35℃)环境中暴露于吡虫啉农药的蜜蜂体内抗菌肽基因转录水平表达受到抑制更为强烈。这些免疫效应抗菌肽的下调表明蜜蜂先天免疫系统可能受到吡虫啉农药的胁迫，对比蜂群正常温度，孵化温度(35℃)环境下的蜜蜂免疫系统受到吡虫啉胁迫后影响更为严重。

CYP450、GST和CarE是昆虫体内存在的3种重要的解毒酶，在蜜蜂内源化合物合成、信号转导和农药代谢等方面起着非常重要的作用。CYP450和CarE是第一解毒阶段主要解毒酶，GST主要作用在第二阶段(Claudianosetal., 2006; Berenbaum and Johnson, 2015)。本研究对以上3种酶的比活力进行测定和比较，结果显示LC10剂量吡虫啉农药处理可以显著诱导CYP450和CarE激活，这与前人的研究结果一致(孟丽峰, 2013)。孟丽峰(2013)发现饲喂不同浓度的吡虫啉农药，蜜蜂体内的GST的可激活浓度范围偏高(LC50～LC90)。在本研究中也发现GST活性没出现显著变化，极有可能是由于试验选取的LC10未达到激活阈浓度。此外，本研究比较了暴露于两种不同温度环境下蜜蜂吡虫啉胁迫体内解毒酶活性的变化，发现在25℃环境中蜜蜂体内CYP450的激活程度更为明显,表明在不同温度环境蜜蜂代谢外源毒素吡虫啉存在差异，且可能在蜂群最适温度环境中代谢效果更理想，这也可能是蜜蜂在孵化温度中死亡率增加的原因。乙酰胆碱酯酶是生物神经传导中的一种关键性酶，能降解突触之间的乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递(Soreq and Seidman, 2001)。新烟碱类农药抑制细胞色素P450解毒酶活性(Iwasaetal., 2004)，同时与病原体联合胁迫削弱蜜蜂的免疫，使蜜蜂易感病(Vidauetal., 2011; Pettisetal., 2012)。吡虫啉是典型的新烟碱类神经性毒素，能够与乙酰胆碱竞争受体的结合部位，阻断昆虫的正常神经信号传递，使得神经系统奔溃，甚至导致昆虫死亡(Matsudaetal., 2001; Cresswell, 2011)。已有大量研究报道发现，吡虫啉农药会降低昆虫体内AchE的活性，也会使蜜蜂脑神经细胞凋亡(吴艳艳等, 2003)。本研究结果也证实吡虫啉胁迫后蜜蜂脑部AchE的活性显著受到抑制，而且在35℃环境中抑制更为显著，这可能会蜜蜂的学习记忆、导航定位等生理功能产生影响。

综上所述，环境因子会与农药产生协同效应进而加重农药的急性致死毒性，这为蜜蜂安全性保护和农药安全使用评价提供新的方向。然而，研究结果说明成年蜜蜂似乎更加适应25℃环境，而不是发育温度35℃，这是一个值得继续研究的课题。