基于网络药理学探讨山药治疗糖尿病心肌病的作用机制

黄楠楠，王锴华，陈珊，孙爽，杨德强，张春晶，都晓伟

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

山药来自于薯蓣科植物薯蓣，从中医学的角度讲，其性平，味甘，能补脾养胃、补肾涩精、生津益肺，是中华人民共和国国家卫生健康委员会公布的药食同源类中药的一种[1-3]。山药的药理作用多样，其可以通过药材中含量最高的山药多糖起到降血糖的作用并且可以进一步的调节血脂[4-6]，还可调节脾胃抑制胃排空和血清淀粉酶的分泌，增强小肠的吸收作用[7]，并且山药可以促进淋巴细胞的增殖，从而起到免疫调节和抗肿瘤等药理作用[8-9]。

糖尿病被认为是同冠心病一样危险的疾病。30%以上的糖尿病患者都有不同程度的心肌功能损伤，并渐渐的发展成为糖尿病心肌病(DCM)[10]。糖尿病心肌病的发病机制有很多，作用也很复杂，涉及钙离子的处理、氧化应激、胰岛素的代谢信号异常、葡萄糖毒性、肾素-血管紧张素-醛固酮系统等[11]。糖尿病心肌病可以引起患者心脏病变，心肌代谢紊乱，心肌细胞变大增殖从而导致心肌肥大等不良症状[12]。

网络药理学是产生于网络生物学的概念，其目的是改良和完善药理学的相关研究，使其更加多样的一种方法。其认为药物不是只作用于一个靶点，而是通过多靶点间的相互作用产生效果，同中药的思想不谋而合。所以通过网络药理学来分析中药活性成分的药理作用，可以为该领域提供很大帮助[13-14]。

关于山药治疗糖尿病心肌病的研究，大多都是将山药作为复方中的一味药材，通过复方整体来研究糖尿病心肌病的治疗，例如山茱萸与山药配伍可以保护小鼠心肌[15]。同时，有多位学者证明，山药及相关药材和提取物具有很好的抗氧化和清除自由基的作用[16-17]。并且还有学者进一步发现了山药能明显降低糖尿病小鼠心肌组织内过氧化脂质含量[18]，这也就证明了山药能保护心肌组织。本篇文章主要探讨关于山药治疗糖尿病心肌病的作用机制，并利用网络药理学的方法挖掘山药治疗糖尿病心肌病的重要成分及其作用的靶点和通路，体现中药在治疗慢性疾病中的优势，为今后中药活性物质研究做出贡献。

1 材料与方法

1.1 山药活性成分的收集和筛选

经过文献调研，本次论文中山药的活性成分来自于TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，https://tcmspw.com/index.php)数据库[19]。该数据库可以捕捉药物、疾病、靶点之间的关系，并且可以检索中药及其活性成分，是网络药理学中常用数据库之一。根据其研究特性和具体情况，对检索出的活性成分进行筛选，以参数OB%(口服利用度)≥30%、DL(类药性)≥0.18为限制条件，筛选出山药的活性成分。

1.2 山药活性成分的靶点预测

Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库是一款能提供蛋白质序列及其功能的数据库，包含了多个物种，检索时选用的是Reviewed(已证明)和Humam(人类)物种来增强数据的可信度[20]。通过TCMSP数据库寻找山药活性成分的蛋白质靶点，在Uniport数据库寻找山药活性成分的蛋白质靶点所对应的基因名称，将其转换，以便后续分析和探讨。

1.3 糖尿病心肌病靶点的收集

糖尿病心肌病的靶点则是利用OMIM[21](Online Mendelian Inheritance in Man，https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库对“Diabetic cardiomyopathy”进行检索，经去重、取并集后得到糖尿病心肌病的疾病靶点数据库。

1.4 交集基因的获取

将筛选出的山药活性成分靶点基因和糖尿病心肌病的疾病靶点基因取交集，并利用在线网站(http://en.findeen.com/venny2.0.html)Venny绘制Venn图，得到交集靶点。

1.5 “山药-活性成分-疾病-靶点”网络图的绘制

Cytoscape软件(Version3.7.2)是一款利用图形化的方法显示网络并且可以对网络中各项数据进行相关的分析以及编辑的软件，将符合要求的山药的活性成分转换成为相应的简称，并将活性成分和糖尿病心肌病共有的靶点导入其中，构建山药活性成分和糖尿病心肌病的“山药-活性成分-疾病-靶点”网络图。

1.6 PPI网络图的构建

PPI(protein-protein interaction)为蛋白质-蛋白质相互作用，选出前文所提到的中药活性成分和疾病的交集靶点，使用STRING分析这些基因的相互作用关系，可以得到关键作用靶点，最后将数据导入Cytoscape软件绘制蛋白质互作图。STRING(https://string-db.org/)是一个可以获取已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用的数据库。交互包括直接和间接关联，它们的证据主要源于计算预测，生物之间的知识转移以及其他数据库的交互作用。

1.7 生物通路分析与功能富集

DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库有着一套全面的功能注释工具，其功能全面，可以了解大量基因背后的生物学含义[22-23]。将疾病的交集靶点导入DAVID数据库中，选择智人物种，并在基因列表下方点击“OFFICE_GENE_SYMBOL”识别和“Gene List”然后进行分析。分析完毕后，分别选择通路中的KEGG分析和GO生物富集分析，依据信息和数据，利用在线作图工具微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)做出KEGG气泡图和三种GO分析的水平条状图，最终根据数据和表格分析对结果进行讨论。

2 结果

2.1 山药活性成分及其靶点信息

通过TCMSP数据库的检索，共检索出符合参数OB%≥30%、DL≥0.18为限制条件的成分共计16种，靶点142个，经过去重，删去无效靶点之后共得山药活性成分靶点69个，详细信息见表1。

表1 山药活性成分基本信息

2.2 糖尿病心肌病靶点获取

通过OMIM数据库、GeneCards数据库的寻找，经过取并集后去重，得到疾病靶点3 922个。

2.3 交集基因的获取

将得到的糖尿病心肌病的靶点与山药活性成分的靶点利用在线作图软件取交集，得到疾病靶点3 922个约占总基因数的98.3%，山药活性成分的69个靶点约占总基因数的0.6%，交集基因47个约占总基因数的1.2%，并且得到Venn图，见图1。图中Drug代表山药活性成分的靶点，Disease代表糖尿病心肌病的靶点。

图1 山药活性成分靶点与糖尿病心肌病靶点Venn图

2.4 “中药-活性成分-靶点-疾病”网络图的绘制

利用Cytoscape软件对筛选出的47个靶点以及对应的10个活性成分作图，得到节点59个，连线140个。圆形代表中药材山药，八边形代表山药的活性成分，菱形代表交集靶点，圆角正方形代表疾病糖尿病心肌病，网络图(见图2)，网络图详细信息(见表2)。其中表2的度值与对应节点连线的数量成正比。

图2 “中药-活性成分-靶点-疾病”网络图

表2 “中药-活性成分-靶点-疾病”网络图详细信息

2.5 PPI网络图的绘制以及关键靶点

利用STRING对47个交集基因进行相互作用分析，并将结果导入Cytoscape软件，绘制山药活性成分及糖尿病心肌病的交集靶点PPI网络图(见图3)，根据度值筛选中位数11得到25个关键靶点。

2.6 KEGG通路分析

将疾病的交集靶点导入DAVID数据库中后，分析导出数据，共有通路63条，对数据进行COUNT>3的筛选得到数据，应用在线工具绘制KEGG通路气泡图(见图4)。图中X轴表示山药活性成分和疾病交集基因的富集情况，Y轴表示与治疗糖尿病心肌病相关的KEGG通路，图中气泡颜色越红越亮就表示靶点的P值越小，气泡面积越大表示通路上的靶点越多。

图3 PPI网络图

图4 KEGG通路分析气泡图

由图可知，鞘脂信号通路(Sphingolipid signaling pathway)、心肌细胞肾上腺素能信号通路(Adrenergic signaling in cardiomyocytes)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、cGMP-PKG信号通路(cGMP-PKG signaling pathway)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)、钙信号通路(Calcium signaling pathway)和PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等是治疗的主要信号通路。

2.7 GO富集分析

在DAVID数据库给出的结果中选择GO-BP、GO-CC、GO-MF 3种GO富集分析，分别得到170、27和60条信息，按照KEGG的筛选标准(COUNT>3)得到130个结果，对所得的数据进行处理运用在线作图工具绘制3种GO分析的水平条形图，见图5。

图中X轴为P值的负对数，Y轴代表各个通路的名称，蓝色数据为GO-BP分析，浅蓝色为GO-CC分析，橙色为GO-MF分析，整体水平条形图按照P值由大到小分类排列，经过整理得到与糖尿病心肌病相关的生物过程，如氧化还原酶活性、氧化还原过程、凋亡过程的负调控过程等。

3 讨论

中药成分多样而复杂，在其发挥药理作用时通常会作用于身体的多个靶点，参与不同的信号通路和生物过程从而达到治疗相关疾病的目的。本研究是首次利用网络药理学的方法研究单味中药山药对治疗糖尿病心肌病的作用机制，并且在这基础上构建了“中药-成分-疾病-靶点”网络图，从多个角度出发，探究山药治疗糖尿病心肌病的作用靶点、信号通路和生物进程，从而以网络药理学的角度阐述其作用机制。

Sun X等研究发现花旗松素可以过抑制氧化应激和细胞凋亡在体内和体外预防糖尿病性心肌病[24]，而在本次研究中经过GO-BP分析发现了与抑制氧化应激和细胞凋亡的生物过程oxidoreductase activity、oxidation-reduction process、negative regulation of apoptotic process等，说明了山药治疗糖尿病心肌病的生物进程。

图5 GO富集分析水平条形图

薯蓣皂苷元在治疗糖尿病及其并发症中有着重要的作用[25-26]。在糖尿病治疗中其可以通过IRS-1、PI3K-Akt信号通路减弱高脂饮食诱导的脂肪对胰岛素的抵抗力[27]。Wei Q等利用链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠心肌模型进行试验，发现薯蓣皂苷元可以通过NO-sGC-cGMP-PKG通路调节小鼠的心肌细胞[28]。本实验通过数据挖掘发现cGMP-PKG是山药治疗糖尿病心肌病的重要通路，与实验相符。Pi W X发现薯蓣皂苷元也可通过利用减少大鼠心肌细胞的氧化应激和凋亡来预防高糖诱导的心肌损伤，与前文所叙述的花旗松素机制类似[29]。除此之外，薯蓣皂苷元还可以通过MicroRNAs等途径[30-31]来调节氧化应激和细胞凋亡作用。

在酪氨酸代谢中，发现薯蓣皂苷元还有抑制酪氨酸酶的作用[32-33]，而在糖尿病心肌病中，酪氨酸代谢也是重要的一个环节[34-36]，关于其相关机制，还有待研究。

综上所述，经数据分析山药含有的薯蓣皂苷元和花旗松素可能是治疗糖尿病心肌病的主要活性成分，推测其分别通过AKT1、NOS3、TP53、VEGFA、TP53等核心靶点，通过PI3K-Akt、cGMP-PKG以及MicroRNAs等主要途径来诱导高糖环境下的心肌细胞凋亡来防止心肌细胞肥大，从而治疗糖尿病心肌病。

本研究为系统开展山药治疗糖尿病心肌病的实验研究及临床应用提供理论依据，也为中药治疗糖尿病心肌病及其相关药物靶点的研究提供了新的研究思路和方法。但由于数据库更新时间问题，有些山药的活性成分还未被添加到数据库中，并且其作用靶点尚未明确，治疗糖尿病心肌病的作用靶点也不断更新之中，而且，由于药物吸收的多样性，并不是所有活性成分和所有治疗都是利用口服的方式吸收药物，除此之外，药物的首过效应也会一定的影响，以上这些因素都会致使本研究具有一定的局限性。同时，由于中药中化学成分复杂，山药多作为食品应用于日常生活中，这就导致其活性成分的提取方法有所不同，最终达到的治疗效果也不同。这些问题有待于后续进行更为深入的分析和验证。