基于“阳中求阴”理论研究左归丸对肾阴虚证能量代谢的影响

李璐，梁永林,2*，安冬，毛慧芳，葛开发，李东顶，薛进旭

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.敦煌医学与转化教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000)

“阳中求阴”是张景岳基于阴阳互根互用关系认识所创立的治疗肾阴虚证的原则，正如张景岳言：“阴阳之理，原自互根，彼此相须，缺一不可。无阳则阴无以生，无阴则阳无以化”[1]，因此，在治疗阴阳虚损疾患时应根据阴阳损伤之主次，因阴虚而损阳者，应补阴而化阳；因阳虚而损及阴者，应补阳而生阴[2]。故《景岳全书·新方八阵略》所言：“善补阳者，必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷……以精气分阴阳，则阴阳不可离。”左归丸作为“阳中求阴”的代表方，充分体现张氏“阳中求阴，阴得阳升则泉源不竭”的补肾原则。相关研究表明[3-4]，肾阴虚证与能量代谢相关。那么，左归丸治疗肾阴虚证的作用机制是否与能量代谢有关？能量代谢对肾阴虚证有什么影响？基于此，本实验采用灌胃甲状腺素与利血平混合悬浮液制备肾阴虚大鼠动物模型，将左归丸拆分为滋阴药与补阳药，并运用左归丸对其进行干预，观察线粒体能量代谢在左归丸组、滋阴组及补阳组干预下的变化规律，论证左归丸“阳中求阴”配伍作用机理。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠56只，体质量(200±20)g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，饲养于中国农业科学院兰州兽医研究所动物实验室。饲养环境：室内温度(22±2)℃，相对湿度50%～60%，12 h光照和夜循环，自由饮水摄食。SPF级动物质量合格证号：SCXK(甘)2015-0001。

1.2 药品及试剂

1)左归丸配伍组:熟地黄24 g，枸杞12 g，山药12 g，山茱萸12 g，龟板胶(醋龟板)12 g，鹿角胶(鹿角霜)12 g，川牛膝9 g，菟丝子12 g。2)滋阴组：熟地黄24 g，山药12 g，山茱萸12 g，枸杞12 g，龟板胶(醋龟板)12 g，川牛膝9 g。3)补阳组：菟丝子12 g，鹿角胶(鹿角霜)12 g。以上中药材均采购于甘肃中医药大学附属医院药房,饮片质量经过鉴定符合《中华人民共和国药典》规定。将上述各配伍组的药物总重量(g)与水(mL)的比例定为1∶10，由于含有先煎的药物(鹿角霜、醋龟板)，所以先取总水量20%的水先煎30 min，同时将其余药物加总水量的50%进行浸泡30 min，然后将先煎的药物总量放入浸泡后的药物用武火待煮沸后调至文火保持微沸30 min，过滤，取剩余30%的水量与过滤残渣进行混合，立刻进行第2次煎煮，用武火煮沸后调至文火保持微沸30 min然后过滤。将2次滤液进行混合，将其浓缩至含生药1 g/mL，4 ℃恒温贮存备用。

甲状腺素片(山东省惠诺药业有限公司，H37020075)；复方利血平片(山西云鹏制药有限公司，H14023921)；Na+-K+-ATPase、LDH、SDH、CCO活性及ATP含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要仪器

高速冷冻离心机(5424R)；酶标仪(iMark)；恒温培养箱(DNP-9022)；超低温冰箱(DW-HL528)；电镜修块机(EM TRIM2)；电镜切片机(EM UC7)；电镜采图机(HT7700)。

2 实验方法

2.1 动物造模与分组

SPF级雄性SD大鼠56只，按照随机分组原则分为对照组8只和模型组48只，适合性饲养1周后，模型组大鼠灌胃甲状腺素片(7.5 mg/100 g)和利血平(0.08 mg/100 g)，二者混合为2 mL的混悬液，每日1次，观察2周[5]，制备肾阴虚证大鼠模型，造模成功后随机分为模型组、滋阴组、补阳组和左归丸组。

模型评价：模型组大鼠出现肛温升高，体质量增长缓慢或体质量下降，自主活动量增多，毛发干枯，不易抓取，饮水量增加，且血清中cAMP/cGMP比值升高为造模成功[6]。

2.2 药物干预

参考李仪奎主编的《中药药理实验方法学》及人与动物体表面积换算系数计算给药剂量，再依据预实验给药方法与剂量得出：左归丸组按照生药剂量9.45 g/kg灌胃，滋阴组按照生药剂量为7.29 g/kg灌胃，补阳组按照生药剂量2.16 g/kg灌胃，灌胃体积均为7.5 mL/kg，对照组及模型组灌胃等体积生理盐水，每日1次。

2.3 指标采集与检测

大鼠末次给药后禁食过夜后,腹腔注射10%水合氯醛溶液，按0.3 mL/100 g的剂量对大鼠进行麻醉，待麻醉生效后，快速取下肝脏组织，放入PBS缓冲液(提前预冷制备)中洗去残余血液，然后用过滤纸把残留在肝组织表面的PBS缓冲液吸干净，用剪刀将放置于预冷的烧杯中的肝脏在冰浴上剪碎成泥状，转移到预冷的玻璃均浆器，匀浆。将匀浆液离心，3 000 rpm，10 min，提取上清，除去脂肪类物质，沉淀即为粗制线粒体[7]。用酶标法检测Na+-K+-ATPase、LDH、SDH、CCO活性及ATP含量的变化，透射电镜下观察肝组织中线粒体结构的超微结构变化。

2.4 统计学处理

3 实验结果

3.1 模型评价

与对照组比较，模型组大鼠出现暴躁不安、喜动、饮水量增加、形体消瘦、肛温升高、毛发干枯、不易抓取、大便干燥等这些症状与体征，并且检测血清中cAMP/cGMP比值显著性升高(P<0.01)；表明制备肾阴虚证动物模型成功。见表1。

表1 对照组和模型组cAMP/cGMP比值的比较

3.2 各组实验大鼠肛温及体质量变化情况比较

与对照组相比，模型组大鼠出现肛温升高，体质量降低，自主活动量增多，毛发干枯，不易抓取，饮水量增加，且差异显著(P<0.01)。与模型组相比，左归丸组情况有所改善接近对照组，效果优于滋阴组与补阳组，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与左归丸组比，滋阴组效果优于补阳组，且差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2、3，见图1、2。

表2 各组实验大鼠肛温变化情况比较

表3 各组实验大鼠体质量变化情况比较

图1 各组实验大鼠肛温变化

图2 各组实验大鼠体质量变化

3.3 各组实验大鼠Na+-K+-ATPase、LDH、SDH、CCO活性及ATP含量的变化

与对照组比较，模型组大鼠Na+-K+-ATPase、LDH、SDH、CCO活性及ATP含量明显升高(P<0.01)，差异具有统计学意义；与模型组比较，左归丸组上述指标明显下降且疗效优于滋阴组与补阳组，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，与左归丸组比较，Na+-K+-ATPase、SDH活性及ATP含量滋阴组较接近，补阳组欠佳，差异具有统计学意义(P<0.05)；而LDH、CCO活性滋阴组、补阳组与左归丸组之间比较无统计学意义。见表4。

表4 各组大鼠Na+-K+-ATPase、LDH、SDH、CCO活性及ATP含量变化情况比较

3.4 透射电镜下观察肝线粒体结构变化

对照组线粒体结构清晰，嵴排列整齐，膜结构完整，线粒体数量多。与对照组相比，模型组线粒体发生明显肿胀，嵴排列紊乱断裂消失，膜结构不完整；与模型组相比，滋阴组与补阳组线粒体结构较完整，嵴排列较为整齐，膜结构较正常。左归丸组效果较好，膜结构完整，线粒体嵴数量增加清晰可见。见图3。

图3 肝组织电镜下线粒体图片(×7000)

4 讨论

肾阴虚大鼠表现出暴躁不安、喜动、饮水量增加、形体消瘦、肛温升高、毛发干枯、不易抓取、大便干燥等这些症状与体征与现代研究认为肾阴虚时基础代谢增强，产热及能量水平升高，反应兴奋等虚热症状等症状一致[8]。

中医理论认为，“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也”，内寄元阴元阳，阴阳二者可相互资生，正如《素问·生气通天论》言:“阴者，藏精而起亟也；阳者，卫外而为固也”[9],说明阴阳互根，精气互生，《黄帝内经》又言: “阳为气，阴为味。味归形，形归气，气归精，精归化；精食气，形食味，化生精，气生形。味伤形，气伤精；精化为气，气为阳，阳必生于阴；精为阴，阴必生于阳。所以精之与气，本自互生”[10]，《难经》认为左肾为肾属水主阴，右肾为命门属火主阳。梁永林教授基于“三阴三阳”开阖枢理论从人体气机运行角度对肾阴虚证进行解读，认为子时始，以少阴为枢，左肾枢厥阴心包、少阳三焦至太阴肺，此肾气运行以肝木系统为途径，午时始，以少阳三焦为枢，右肾枢太阳膀胱阖于阳明大肠，此时阳气右降于右肾(相火)，相火源于肾而寄生于肝。正如叶天士云：“肝者，将军之官，相火寄内”[11]。相火藏于肾水中，所以在左肾阴的作用下，右肾阳才不上浮， 若左肾阴水不足，阴不敛阳，右命门相火妄动，以三焦为枢，可传交至三焦心包，导致三焦与心包火旺，出现心烦急躁、阴虚火旺等症状，又因虚火宜补不宜泻，因此在治疗肾阴虚证时通过滋肾阴涵右肾阳，滋阴以制约右肾阳的上浮而导致的三焦、心包火旺。故针对肾阴虚证时，阴津蒸化之源,重在温补肾阳, 激发命门之火，使阳气蒸发,命火升动，阴液上腾四布，阴亏自复[12]。因此，左归丸“阳中求阴”配伍当以滋阴(熟地黄、山药、山茱萸、枸杞、龟板胶、川牛膝)为主，同时适当辅以扶阳(菟丝子、鹿角胶)之品，使补阴而不抑败真火，育阴以涵阳。通过观察本实验，表明滋阴组与补阳组因无法完全降低线粒体能量代谢相关酶活性及修复线粒体膜结构，未完全改善机体能量代谢状态。而左归丸全方组治疗效果接近对照组，充分体现张氏“阳中求阴，阴得阳升则泉源不竭”的补肾原则，进一步体现了“阳中求阴”的配伍价值。

本实验采用甲状腺素及利血平诱导肾阴虚证造模成功后，运用酶联免疫法、透射电镜等探究肾阴虚证时线粒体能量代谢的变化，大鼠肝线粒体出现能量代谢障碍，表现在肝线粒体酶活性及ATP含量升高，左归丸组可降低肾阴虚大鼠SDH、CCO、LDH、Na+-K+-ATPase的酶活性，保证三羧酸循环和氧化磷酸化的正常进行，改善肾阴虚症状，表明左归丸可通过调节肝线粒体酶活性改善机体能量代谢，可能是左归丸治疗肾阴虚证的机制之一， 由于线粒体膜结构损伤会导致呼吸链无法进行电子的传递与三羧酸循环的正常进行，左归丸通过改善模型组大鼠线粒体病理结构，修复线粒体膜结构，改善能量代谢，表明左归丸可通过恢复线粒体结构来调节机体能量代谢水平，这可能也是左归丸治疗肾阴虚证的机制之一。

综上所述，本实验从线粒体能量代谢角度出发，从微观角度探讨中医药治疗能量代谢异常的作用机理，并且通过观察比较左归丸拆方组(滋阴组、补阳组)大鼠肝线粒体酶活性与线粒体结构的变化，证实左归丸“阳中求阴”理论的临床意义与价值，更进一步证实肾阴虚证与线粒体能量代谢之间的相关性，期对今后以线粒体作为靶点探讨疾病的治疗机理提供科学的实验依据。