白花蛇舌草总黄酮大孔树脂纯化工艺及其体内抑瘤作用的研究

王雪，夏顺利，刘景楠，凌佳音，王秋兰，林丽，韩涛

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

白花蛇舌草系茜草科耳草属植物白花蛇舌草[Oldenlandiadiffusa(Willd.)Roxb. ]的干燥全草，别名蛇舌草、尖刀草、羊须草等，是一种傣族药物，见于《广西中药志》[1]，性味为苦、甘、寒，具有清热解毒、消痈、利湿通淋之功效。白花蛇舌草是2015版《中国药典》中收录的花红颗粒、抗骨髓炎片、炎宁糖浆等制剂中的配方中药之一[2],临床常用于毒蛇咬伤、咽喉肿痛、保护肝损伤、治疗恶性肿瘤等[3-4]。目前，白花蛇舌草注射液治疗癌症发热已经取得了较好的临床效果[5]。据报道[6]，白花蛇舌草含蒽醌类、黄酮类、萜类、甾醇类、有机酸类等多种活性成分，其总黄酮具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、增强免疫功能及抗氧化等药理作用[7-9]。

本研究对5种不同性能的树脂D-101、AB-8、NKA-9、HDP-826及聚酰胺进行筛选，以吸附、解析效果为指标，结合单因素试验考察大孔树脂纯化总黄酮的工艺参数(上样质量浓度、上样体积、上样体积流量、洗脱剂浓度、洗脱体积、洗脱剂体积流量)，筛选出最佳的纯化工艺，并考察纯化后白花蛇舌草总黄酮对MFC荷瘤小鼠的抑瘤作用，以期为后续相关抗肿瘤机制的研究及临床应用提供一定的依据。

1 实验材料

1.1 药物、瘤株及动物

白花蛇舌草，经甘肃中医药大学林丽老师鉴定为茜草科白花蛇舌草[Oldenlandiadiffusa(Willd.)Roxb.] 的干燥全草(产地：河南驻马店，留存样本于生药标本室)；芦丁(上海源叶生物科技有限公司，批号：B20771)；小鼠前胃癌细胞(Mouse forestomach carcinoma，MFC；上海富衡生物科技有限公司)；雄性C57BL/6小鼠60只，SPF级，体质量16～18 g，购自甘肃中医药大学，许可证号：SCXK(甘)2015-0002。

1.2 试剂及仪器

大孔吸附树脂D-101、AB-8、NKA-9、HPD-826树脂、聚酰胺(柱层析用，60～90目，江苏常州市长丰化工有限公司)；无水乙醇(天津大茂化学试剂厂，分析纯)；三氯化铝(天津大茂化学试剂厂，分析纯)；RPMI1640培养基(HyClone，Lot No.AE29456629)；PBS(HyClone，Lot No.AF29449009)；胎牛血清(Lot No.504103119，Yeasen Biotech Co.,Ltd)；胰蛋白酶(Lot No.T6912580，Yeasen Biotech Co.,Ltd)；注射用环磷酰胺(CTX，国药准字H32020857，江苏恒瑞医药股份有限公司)；微量紫外可见分光光度计(UV-2600，岛津企业管理有限公司)；电子天平(EX2202ZH/E，奥豪斯仪器有限公司)；分析天平(BS224S，生物实验中心)；超声波清洗器(KH3200，昆山禾创超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(V-700，步琦实验室设备贸易有限公司)；循环水式多用真空泵(SHZ-DⅢ，甘肃宜平仪器有限公司)；CO2恒温培养箱(Thermo Scientific Forma 371)；超净工作台(CJ-2S，天津市泰斯特仪器有限公司)；电子数显游标卡尺(上海量具刃具厂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

精密称取前期实验所得的白花蛇舌草总黄酮浸膏0.32 g于烧杯中，加蒸馏水适量，超声处理10 min，使其充分溶解，抽滤后即得澄清供试品溶液，备用。

2.2 总黄酬含量测定方法

参考文献[10]，以芦丁为对照品，采用三氯化铝比色法测定白花蛇舌草总黄酮含量。精密称取芦丁对照品0.010 0 g, 加95%乙醇适量，超声加热溶解后，以95%乙醇定容至100 mL摇匀，配成0.1 mg/mL的标准溶液，备用。

显色剂配制:取三氯化铝约1.00 g，精密称定，用无水乙醇溶解并定容至100 mL，得到1%三氯化铝溶液，备用。

最大吸收波长的确定：移取供试品溶液、芦丁对照溶液各3 mL于10 mL容量瓶中，加入4 mL 1% 的三氯化铝溶液，用95%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min。同法制备空白液。在300～ 500 nm波长范围内进行扫描，记录紫外可见吸收光谱，选择400 nm为测定波长。

标准曲线的绘制：分别取芦丁标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL至10 mL容量瓶，加入4 mL 1% AlCl3溶液，95%乙醇定容至10 mL，摇匀，静置15 min。于400 nm处测定吸光度值，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线图。得到线性回归方程y=28.718x-0.011 9，r=0.999 5，芦丁在0.005～0.035 mg/mL范围内具良好的线性关系。

总黄酮含量的测定：精密量取3.0 mL的样品液于10 mL的容量瓶中，按照“2.2”项操作，测定并计算总黄酮的含量。

2.3 大孔吸附树脂的筛选

2.3.1 树脂的预处理

3倍体积95%乙醇浸泡24 h充分溶胀，用95%乙醇冲洗，至醇液加水不产生浑浊为止，再用纯化水洗至无醇味，备用。储存用95%乙醇浸泡，临用前用纯化水冲洗至中性，即可使用[11-12]。

2.3.2 树脂型号的筛选

通过静态吸附与解吸附试验，优选树脂型号D101、AB-8、NKA-9、HPD-826以及聚酰胺，共计5种。

2.3.2.1 静态吸附

准确称取2.0 g经预处理的树脂放入具塞三角瓶中，加入30 mL的样品溶液，每隔5 min振摇10 s，持续2 h，然后静置24 h，使其达到饱和吸附，吸取上层液测定总黄酮浓度，按下面公式计算各树脂室温下的吸附量以及吸附率：

2.3.2.2 静态解吸附

静态吸附后的树脂过滤抽干，加40 mL 95%乙醇解吸附，恒温振荡器上振荡24 h，过滤，测定滤液中白花蛇舌草总黄酮含量，计算解吸率：

以上公式中，C0表示供试品溶液初始的总黄酮浓度(mg/mL)；C1表示吸附后上清液中剩余的总黄酮浓度(mg/mL)；V1表示供试品溶液的体积(mL)，m表示树脂重量(g)；C2表示解吸液的质量浓度(mg/mL)。

表1 不同树脂的性能及对白花蛇舌草总黄酮的吸附解吸情况(n=3)

通过静态吸附和解吸附试验比较，由表1可知在5种类型的树脂中，AB-8型树脂和HPD-826型树脂对白花蛇舌草总黄酮的吸附性能相当，吸附量分别为0.161 5、0.162 5 mg/g；吸附率分别为77.46%、77.94%；D-101、NKA-9吸附率分别为74.34%、74.58%，其中D-101解吸率最高为97.49%，其解吸率RSD值为2.71%(n=3)。综合以上数据，5种树脂吸附性能相差不大，D101型树脂解吸性能更好，且回收率达最高72.47%，因此选择D-101型大孔吸附树脂用于白花蛇舌草总黄酮的纯化。

2.3.3 D-101树脂静态吸附动力学行为曲线

通过静态吸附和解吸附试验筛选出最佳树脂D-101作为纯化树脂，进一步考察D-101树脂对白花蛇舌草总黄酮静态吸附动力学行为。准确称取该树脂5.0 g，置于100 mL锥形瓶中，加样品溶液50 mL，每30 min振摇2 min，静置。每隔1 h吸取上清液约2 mL测定总黄酮含量，至吸附饱和停止测定，根据所得数据绘制出静态吸附曲线。由图1可知，D-101树脂对白花蛇舌草总黄酮的吸附为快速平衡型，4～5 h基本达到平衡，表现出良好的静态吸附动力学特性，适用于白花蛇舌草总黄酮纯化。

2.3.4 D-101树脂洗脱剂浓度的考察

将“2.4.2”项下的饱和吸附后树脂过滤、抽干，各称取0.5 g于100 mL锥形瓶中，分别加入20 mL不同体积分数30%、50%、70%、80%、95%的乙醇作为解吸剂，振荡摇匀，24 h后测定总黄酮含量。由图2可知，乙醇浓度在30%～80%之间，总黄酮质量浓度逐渐升高，当浓度达到95%时，总黄酮质量浓度开始降低，因此选择80%的乙醇为解吸液。

图1 D-101树脂静态吸附动力学曲线

图2 乙醇体积分数对总黄酮质量浓度的影响

2.4 D-101大孔树脂动态吸附工艺参数考察

2.4.1 上样质量浓度对D-101树脂吸附率的影响

准确称取等份经过预处理的D-101树脂，每份(湿) 5.0 g，分别湿法装入(2 cm×30 cm)具阀色谱柱中，精确加入质量浓度分别为0.312、0.936、1.560、 2.184、2.808 mg/mL的供试品溶液各30 mL，以2 mL/min的流速上样，测定总黄酮含量，计算吸附率。由图3可知，当上样质量浓度为2.184 mg/mL时，吸附率最高为77.54%，因此选择2.184 mg/mL为最佳上样质量浓度。

图3 上样质量浓度对吸附率的影响

2.4.2 上样体积流量

取已预处理好的树脂5.0 g，上样液为30 mL(2.184 mg/mL)，以不同流速(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min)上样，测定吸附后总黄酮的含量，计算吸附率。由图4可知，吸附率随上样体积流量先增大后降低，当流速为4 mL/min时吸附率又上升，达到最大值81.33%，因此选择上样体积流量为4 mL/min。

图4 上样体积流量对吸附率的影响

2.4.3 泄露曲线的绘制

取已处理好的D-101树脂5.0 g(BV=4.71 mL)，采用湿法装柱，将供试品溶液配制成质量浓度为2.184 mg/mL时上样，流速为4 mL/min，同时收集流出液，每5 mL收集1份洗脱液，并分别测定总黄酮，以流出液体积为横坐标，吸附率为纵坐标，绘制泄露曲线。当流出液中总黄酮质量浓度为上样液总黄酮质量浓度的1/10时，到达泄露点，认为此时为最佳上柱体积[13]。由图5可知，在流出液达到15 mL时吸光度急剧增加，表明总黄酮开始泄露；当达到80 mL时，总黄酮质量浓度基本不再增加，表明树脂对总黄酮的吸附已达到平衡。因此，上样体积选为80 mL。

图5 上样体积对总黄酮质量浓度的的影响

2.4.4 水洗体积

上样吸附的过程中，有水溶性杂质及多糖吸附在树脂上，因此用蒸馏水洗脱已达到吸附平衡的树脂柱，每10 mL收集1份洗脱液，测定每份样品吸光度，直至吸光度趋于稳定，以吸光度对样品份数作图，绘制水洗脱曲线。由图6可知，当水洗脱液收集至第5份(50 mL)时，吸光度基本趋于稳定，说明水溶性杂质基本冲洗干净，因此水洗体积为50 mL。

图6 水洗脱液对吸光度的影响

2.4.5 洗脱液乙醇体积

上样完成后，先用50 mL蒸馏水冲洗杂质及多糖，然后用80%乙醇进行洗脱，每5 mL收集1份洗脱液。共收集20份，测定洗脱液吸光度，以吸光度对洗脱份数作图，绘制乙醇洗脱曲线。由图7可知，当乙醇体积收集到第10份(50 mL)时，吸光度基本趋于零，说明总黄酮已洗脱完全。因此，醇洗体积为50 mL。

图7 醇洗脱液对吸光度的影响

2.4.6 醇洗脱剂体积流量

按上述吸附条件平行上样5份，用50 mL蒸馏水洗脱除去水溶性杂质，然后用50 mL 80% 乙醇分别以1.0、2.0、3. 0、4. 0、5. 0 mL/min的体积流量洗脱，收集洗脱液，测定吸光度，计算解吸率。由图8可知，洗脱体积流量为4 mL/min时，解析率达最大，因此醇洗脱液体积流量为4 mL/min。

图8 醇洗脱液体积流量对解吸率的影响

3 最佳工艺的验证试验

为验证最佳工艺的可行性与稳定性，按照优选出的工艺条件：选择D-101树脂，上样质量浓度为2.184 mg/mL，上样体积为80 mL，树脂的上样量为16 mL/g，上样体积流量为4 mL/min，水洗脱体积为50 mL，醇洗脱为80%乙醇，洗脱体积为50 mL，洗脱体积流量为4 mL/min，反复进行3次平行试验，浓缩洗脱液至干，称其质量，平均干重为0.05 g，纯品占粗提物质量的28.62%，纯度为57.5%左右。

纯度(%)=C×V/M×100%

其中,C：纯化后质量浓度(mg/mL)；V：黄酮溶液体积(mL)；M：黄酮物质干重(g)。

4 白花蛇舌草总黄酮体内抗肿瘤作用

4.1 模型建立、分组及给药

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液在常规条件(37 ℃、饱和湿度、5%CO2) 下培养MFC胃癌细胞至对数生长期，平均细胞密度为5.34×105个/mL。C57BL/6小鼠右侧腋下经75%乙醇消毒后，接种0.2 mL MFC细胞悬液，5～6 d右腋下肉眼可见肿节，待肿瘤生长至5 mm×5 mm左右则表明模型建立成功。将模型小鼠随机分为模型组、阳性组(环磷酰胺)及白花蛇舌草总黄酮高、中、低剂量组，10只/组。另设10只空白组作对照。给药前记录小鼠体质量(给药前体质量)，模型组、空白组灌胃生理盐水，阳性组腹腔注射环磷酰胺 (25 mg/kg) ，白花蛇舌草总黄酮高、中、低剂量组灌胃白花蛇舌草总黄酮 (200、100、50 mg/kg)，1次/d，连续给药8 d。

4.2 肿瘤生长曲线

从接种MFC细胞第7天(即给药第1天)开始，在第7、8、9、11、13、15天分别用游标卡尺测量并计算肿瘤体积(TV)。

TV=a×b2/2

其中,a、b分别表示肿瘤长径、短径。以平均TV值绘制肿瘤生长曲线，见图9。

图9 白花蛇舌草总黄酮干预后的肿瘤生长曲线

4.3 抑瘤率及脏器指数测定

末次给药24 h后，记录小鼠体质量(给药后质量)。颈椎脱臼法处死小鼠，完整剥离肿瘤组织及脾脏，精确测量质量及瘤体长径、短径。

抑瘤率=[(模型组瘤质量-给药组瘤质量) /模型组瘤质量]×100%

脾脏指数=脾脏质量(mg)/体质量(g)

结果如表2所示，与模型组相比，阳性组和白花蛇舌草总黄酮高剂量组小鼠瘤体积、瘤重显著性降低；中、低剂量组瘤重均明显降低(P<0.05或P<0.01)，说明白花蛇舌草总黄酮具有一定的抑瘤作用，高、中、低剂量组抑瘤率分别为66.6%、60.09%、47.36%。与模型组比较，阳性组体质量、脾脏指数显著降低，说明化疗药环磷酰胺具有一定的免疫抑制作用;白花蛇舌草总黄酮高剂量组显示出良好的抗肿瘤活性(P<0.05或P<0.01)，对MFC荷瘤小鼠的肿瘤生长具有抑制作用，其机制可能通过增强免疫机能发挥抗肿瘤作用。

表2 白花蛇舌草总黄酮对MFC荷瘤小鼠体质量、脾脏指数及抑瘤作用的影响

5 讨论

为尽可能提取出白花蛇舌草总黄酮并不破坏其性质，前期实验以酶法-超声提取，选用纤维素-果胶-木蛋白酶，乙醇浓度为60%、酶量为0.7%、酶解时间为90 min、料液比为1:25(g/mL)时，提取方法经中心组合设计-响应面法优选，白花蛇舌草总黄酮提取率最高，为1.95%。近年来，大孔吸附树脂在中药提取分离及纯化中的研究和应用日益增多[14]。本研究通过稳定性高、操作简单的三氯化铝法[10]，结合紫外分光光度计测定白花蛇舌草总黄酮含量，考察D-101、AB-8、HPD-826、NKA-9以及聚酰胺树脂在不同条件下对总黄酮的吸附率和解吸率，不同树脂极性有所差异，故其吸附和解吸性能不同。研究结果显示，D-101型大孔树脂对白花蛇舌草总黄酮具有较好的纯化富集作用，具体工艺参数如下：选用D-101型大孔树脂，上样质量浓度为2.184 mg/mL，上样体积为80 mL，树脂的上样量为16 mL/g，上样体积流量为4 mL/min，水洗脱体积为50 mL，醇洗脱为80%乙醇，洗脱体积为50 mL，洗脱体积流量为4 mL/min，所得精制品中总黄酮纯度达57.5%左右，且操作简便、回收率高。

同时本研究发现，纯化后白花蛇舌草总黄酮具有良好的抗肿瘤活性，可明显抑制MFC荷瘤小鼠瘤体的生长及提高体质量及脾脏指数，提示白花蛇舌草总黄酮可能通过改善免疫功能发挥抗肿瘤作用，其具体机制还需后期继续研究。