血浆游离双链DNA在原发性肝癌中的诊断价值

安仙园 ,袁丹丹 ,徐忆秋 ,沈国荣

(1. 华东疗养院检验科，江苏 无锡 214065； 2. 南京医科大学附属无锡第二医院检验科，江苏 无锡 214002； 3. 苏州大学附属苏州九院检验科，江苏 苏州 215200)

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)分为肝细胞癌、胆管癌以及混合癌。甲胎蛋白(AFP)是肝细胞癌的生物标志物，39%～65%的肝细胞癌患者血浆AFP升高[1]。糖类抗原12-5(CA12-5)、糖类抗原19-9(CA19-9)和癌胚抗原(CEA)作为胃肠道恶性肿瘤诊断的指标，可为胆管癌的诊断提供部分依据[2-4]。虽然如此，PHC诊断到目前为止仍然没有特异性的标志物。为了解决PHC的诊断问题，肿瘤标志物包括AFP、CA19-9、CA12-5和CEA联合用于PHC的诊断已有报道[5-6]。此外，新的生物标志物，例如高尔基体蛋白73(GP73)[7]，glypican-3(GPC-3)[8]和microRNA[9-10]也正在研究中。然而，诊断敏感度和(或)特异度不足限制了这些标志物在临床中的应用。

早期研究表明，定量检测血浆游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)对PHC诊断具有价值[11]。由于cfDNA的定量分析不能提供PHC潜在的分子靶标信息，因此近10多年几乎放弃了对cfDNA定量检测的研究。尽管cfDNA定量分析在肝癌中的应用备受争议，但它具有简单、快速和价格低廉等优点。随着技术的发展， cfDNA的定量检测仍然具有很大的应用价值[12]。

双链DNA (double-stranded DNA，dsDNA)是cfDNA的重要组成部分，复制压力引起的DNA断裂是dsDNA异常产生的重要原因[13]。肝脏作为最大的代谢器官承受巨大的复制压力，因此我们推测血浆dsDNA可能是PHC的标志物。本研究探讨血浆中游离双链DNA(cell-free double-stranded DNA，cf-dsDNA)在PHC诊断中的应用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

招募2019年5月至10月南京医科大学附属无锡第二医院收治的62例PHC患者、41例良性肝病患者以及45例健康对照。PHC和良性肝病的诊断主要基于临床症状、影像学和传统肿瘤标志物检查。按照AFP参考范围(<9 ng/mL)，62例PHC患者中34例为AFP阴性，28例为AFP阳性。PHC的分期根据肿瘤淋巴结转移(tumor node metastasis，TNM)分类进行。

良性肝病包括胆囊炎7例，胆结石5例，肝囊肿2例，肝血管瘤11例，病毒性肝炎12例和肝硬化4例。健康对照的纳入标准：肿瘤标志物、肝炎标志物和体检没有异常。健康个体的排除标准：曾经接受二线治疗，患有良性肿瘤、慢性炎性疾病和自身免疫性疾病。收集术前/治疗前患者和健康对照的清晨空腹外周血。

本研究通过了南京医科大学附属无锡第二医院伦理委员会的审核，项目编号：(2019)伦理审查第(Y-25)号。所有受试者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

磁珠法cf-dsDNA提取试剂盒和磁力架(江苏昱安生物科技有限公司)，Qubit 1×dsDNA HS分析试剂盒和Qubit 3.0荧光计(美国Life Technologies公司)。AFP、CA19-9、CA12-5和CEA电发光定量检测试剂盒和Cobas e602全自动电化学发光分析仪(德国罗氏公司)。

1.3 cf-dsDNA的定量检测

1.3.1 血浆制备 1 900×g离心EDTA抗凝血10 min，收集血浆。再以16 000×g离心10 min。收集血浆，-80℃保存备用。

1.3.2 cf-dsDNA提取 500 μL血浆中加入1 mL裂解吸附液和10 μL蛋白酶K，1 500 r/min 60 ℃振荡10 min。加入10 μL磁珠，1 500 r/min室温振荡10 min。分离磁珠，洗涤后用25 μL洗脱液洗脱收集cf-dsDNA，-20℃保存备用。

1.3.3 cf-dsDNA定量 在195 μL Qubit 1×dsDNA HS分析试剂中加入cf-dsDNA提取物5 μL，混匀后避光室温放置2 min。用Qubit 3.0荧光计以1 μL读数模式检测cf-dsDNA浓度。

1.4 血清AFP、CA19-9、CA12-5和CEA水平测定

2 000×g离心全血30 min，收集血清， -20℃保存备用。用Cobas e602分析仪测定AFP、CA19-9、CA12-5和CEA水平，正常参考上限分别为9 ng/mL、35 U/mL、35 U/mL和5 ng/mL。

1.5 统计学分析

应用SPSS 16.0进行统计分析，数据以中位数(四分位间距)表示。定量参数采用Mann-WhitneyU检验或Kruskal-WallisH检验分析，多组率的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法分析。标志物的诊断效率采用受试者工作特征(ROC)曲线分析，选择约登指数最大的点作为临界值，ROC曲线下面积(AUC)采用双侧95%置信区间报告。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 传统肿瘤标志物和cf-dsDNA在三组研究对象中的差异分析

如表1所示，PHC、良性肝病和健康对照之间，血清AFP、CA19-9、CA12-5、CEA水平均存在显著差异(P均<0.01)，PHC患者血浆cf-dsDNA水平显著高于良性肝病和健康对照者(H=93.54，P<0.01)。

表1 受试者肿瘤标志物水平

2.2 血浆cf-dsDNA水平与PHC患者临床特征的关系

在PHC患者中，cf-dsDNA水平在年龄、性别、AFP水平、PHC类型以及肿瘤大小之间均无明显差异(P均>0.05)，见表2。cf-dsDNA水平与PHC的TNM分期之间存在等级相关性，等级相关系数(rs)为0.311(P=0.013 9)。

表2 cf-dsDNA水平与PHC患者临床特征的关系

2.3 cf-dsDNA在PHC中的诊断作用

单独用于PHC诊断，AFP的AUC为0.742，CA12-5的AUC为0.781，AFP、CA19-9，CA12-5和CEA联合诊断的AUC为0.866。cf-dsDNA 诊断PHC的AUC为0.965。cf-dsDNA联合AFP诊断的AUC为0.976，cf-dsDNA联合所有肿瘤标志物诊断PHC的AUC为0.979。见表3和图1。

表3 各种标志物对PHC的诊断效率

A:传统肿瘤标志物和cf-dsDNA；B:cf-dsDNA联合不同肿瘤标志物图1 各种标志物诊断PHC的ROC曲线

2.4 各标志物在PHC中的阳性率

根据表3中各标志物的临界值，cf-dsDNA在PHC中的阳性率为90.32%(56/62)，AFP的阳性率为45.16%(28/62)，CA19-9的阳性率为48.39%(30/62)，CA12-5的阳性率为70.97%(44/62)，CEA的阳性率为64.52%(40/62)，cf-dsDNA在PHC中的阳性率明显高于传统肿瘤标志物(χ2=36.00，P<0.01)。而cf-dsDNA在良性肝病和健康对照中cf-dsDNA的阳性率分别为9.76%(4/41)和2.22%(1/45)。cf-dsDNA在肝细胞癌、胆管癌和混合型PHC中的阳性率无明显差异(P=0.612 2)，CA19-9和AFP在三者之间的阳性率也无明显差异，而CA12-5和 CEA阳性率在三者之间有显著差异。见表4。cf-dsDNA联合所有传统肿瘤标志物在PHC中的阳性率为87.10%(54/62)。

表4 各种标志物在不同类型PHC中的阳性率 例(%)

3 讨论

PHC的血液学诊断是亟待解决的难点，肿瘤标志物联合诊断是解决方案之一[5-6]。我们的数据显示，单独用于PHC诊断，传统肿瘤标志物中CA12-5的诊断效率最高，其AUC为0.781。应该注意的是，虽然CA12-5用于PHC诊断的理论效率较高，但是CA12-5的临界值低于正常参考上限(35 U/mL)，这明显与临床应用不符。尽管AFP、CA19-9、CA12-5和CEA联合诊断PHC的AUC理论上达到了0.866，但用于诊断的临界值计算较为复杂。除此之外，AFP、CA19-9、CA12-5和CEA还受到例如吸烟、饮酒、血糖水平、年龄、性别、月经、怀孕等因素的影响[14-15]。因此，传统肿瘤标志物单独或联合不能满足临床对PHC诊断的需求。

血浆dsDNA水平可能是PHC的良好标志物[11-12]。本研究中，PHC患者cf-dsDNA水平显著高于良性肝病患者和健康对照。cf-dsDNA作为PHC诊断标志物的AUC为0.965。根据文献报道的标准[16]，我们认为cf-dsDNA水平对PHC具有良好的诊断效率。有研究表明，cfDNA与AFP结合可以提高PHC的诊断效率[17]。但本研究中，cf-ds-DNA与AFP联合或者与所有传统肿瘤标志物联合仅略微提高PHC的诊断效率(AUC分别为0.976和0.979)。与单独的cf-dsDNA相比，cf-dsDNA无论是与CA19-9、CA12-5还是CEA联合都不能明显提高PHC的诊断效率，并且这些联合指标的AUC、敏感度和特异度与cf-dsDNA单独诊断几乎相同。这一结果说明，在联合指标中cf-dsDNA起着至关重要的诊断作用。

值得关注的是，cf-dsDNA水平在AFP阴性和阳性PHC之间以及在PHC类型之间均无明显差异。根据临界值判断，cf-dsDNA在不同类型PHC中的阳性率也无明显差异，但明显高于传统肿瘤标志物。在所有受试者中，PHC患者cf-dsDNA的阳性率明显高于良性肝病和健康对照。且使用联合指标不能提高PHC的阳性率(87.10%)。上述结果表明，cf-dsDNA在各种类型PHC中均具有良好的鉴别诊断能力，可以弥补传统肿瘤标志物的不足。

除了诊断价值之外，本研究结果显示，cf-dsDNA水平与肿瘤大小无关，但与TNM分期有关。这说明cf-dsDNA水平有望用于肿瘤转移的判断，这个推论还需要更多样本的验证。

尽管本研究结论明确，但仍存在一些局限性。首先，基于ROC分析的临界值需要独立验证。其次，PHC病例数量不多，因此应谨慎看待相关推论，尤其是与P值略低于0.05的相关性推论。第三，由于没有进行随访，cf-dsDNA在PHC进展、预后和疗效评估中的应用尚需进一步探讨。综上所述，本研究结果显示cf-dsDNA可作为PHC诊断的良好标志物，随着研究的深入，该结论有望应用于临床。