基于UPLC特征图谱和QAMS对怀牛膝药材质量控制的应用研究

康 浩，孙亮亮，姚应水

(1.安徽中医药高等专科学校 a.药物化学与药物分析教研室；b.医疗系，安徽 芜湖 241003；2.皖南医学院 公共卫生学院 慢性病防制研究所，安徽 芜湖 241002)

怀牛膝主产于河南焦作境内，是临床上常用的“四大怀药”之一[1]，属苋科植物牛膝(AchyranthesbidentataBl.)，药用其干燥根，具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行的功效[2]，研究表明上述功效与其含有的多种活性成分杯苋甾酮、β-蜕皮甾酮及齐墩果酸型三萜皂苷等有关[3]。

目前对怀牛膝质量控制评价的研究方法主要有两大类：一类[4-5]是利用特征图谱法对其化学成分整体模糊信息的反映，另一类[6-8]是对其活性成分含量的精确测定。因怀牛膝活性成分较多，相关对照品难以制备，且制备成本较高等因素影响，2020版《中华人民共和国药典》只收载了易制备对照品的活性成分β-蜕皮甾酮含量测定[2]来评价其质量，但并不能全面科学地进行控制与评价。一测多评法(quantitative analysis of multi-components by single-marker,QAMS)是指以样品中某一典型组分为内标，建立该组分与其他组分之间的相对校正因子(relative correction factor,RCF)，通过RCF计算其他组分的含量，适用于对照品难得或制备成本高或不稳定的情况下同类多成分的同时测定[9-10]。如将超高效液相(ultra performance liquid chromatography,UPLC)特征图谱和QAMS相结合，优势互补，能为更全面科学的评价中药材怀牛膝的质量提供技术支撑[9，11]。

本实验研究建立的基于UPLC特征图谱和QAMS相结合的方法，对怀牛膝中5-羟甲基糠醛、杯苋甾酮和β-蜕皮甾酮3种成分进行标定的同时还能对其进行含量测定，实现了采用易制备的β-蜕皮甾酮一个对照品即能完成其他多个成分的含量测定，为全面有效地控制中药材怀牛膝的质量提供科学有效、简便的技术手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 超高效液相谱仪(Wasters ACQUITY H-CLASS UPLCTM，四元高压泵系统，在线脱气系统，TUV 检测器，Empower 2 工作站,Waters 公司)，KQ-200KDB 型高功率数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；ME 204型电子天平：博特勒-托利多仪器(上海)有限公司；DZF-6090型真空干燥箱：上海精其仪器有限公司。乙腈：色谱纯，美国TEDIA公司；甲酸：色谱纯，美国TEDIA公司；屈臣氏蒸馏水；重蒸水(自制)。

1.2 试药 怀牛膝药材共10批(S1～S10，药材来源见表1)，经安徽中医药高等专科学校药学系赵宝林教授鉴定为正品。β-蜕皮甾酮对照品(上海纯优生物科技有限公司，批号180908，纯度98.80%)，杯苋甾酮对照品(上海纯优生物科技有限公司，批号190218，纯度99.35%)，5-羟甲基糠醛(上海纯优生物科技有限公司，批号190315，纯度98.64%)。

表1 不同产地批次的怀牛膝药材来源

2 方法与结果

2.1 UPLC特征图谱的建立

2.1.1 色谱条件 超高效液相色谱仪(Waters ACQUITY H-CLASS UPLCTM，四元高压泵系统，在线脱气系统，TUV 检测器，Empower 2 工作站,Waters 公司)，Waters BEH C18(1.7 μm,2.1 mm × 100 mm)色谱柱，以乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)进行梯度洗脱(0～1 min,90% B;1～2 min,90% →70 % B;2～5 min,70 % B;5～6 min,70% → 68% B;6～8 min,68% B;8～9 min,68 % → 62% B;9～12 min,62% B)，柱温30 °C，流速 0.2 mL/ min，检测波长250 nm，进样量为1 μL。

2.1.2 对照品溶液 精密称取对照品β-蜕皮甾酮7.52 mg置于1 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，充分摇匀，静置备用；精密称取对照品杯苋甾酮1.56 mg和5-羟甲基糠醛5.06 mg分别置于2 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，充分摇匀，静置备用。精密量取上述静置备用溶液β-蜕皮甾酮0.5 mL、杯苋甾酮和5-羟甲基糠醛溶液各1 mL置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，充分摇匀，静置备用。将上述4种溶液置于4℃冰箱中保存，备用。

2.1.3 供试品溶液 精密称取过四号筛的怀牛膝药材粉末1.0 g，置于有活塞的锥形瓶中，加甲醇与水的混合溶液(1∶1)10 mL，称重，超声提取1 h，冷却置室温重新称重，用甲醇补足到原重量，充分摇匀，至高速离心机中于4℃下，以12 000 r/min离心30 min后，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，续滤液备用。

图1 10批怀牛膝UPLC特征特征图谱

A.怀牛膝药材样品共有峰模式特征图谱；B.β-蜕皮甾酮、杯苋甾酮、5-羟甲基糠醛3种成分混合对照品图谱，2为5-羟甲基糠醛；4为β-蜕皮甾酮；7为杯苋甾酮。

2.1.5 怀牛膝样品特征图谱相似度分析 利用“中药色谱特征图谱相似度评价系统软件2012版”(国家药典委员会)[12]对10批怀牛膝样品(S1～S10)的特征图谱相似度进行分析比较，结果表明相似度均>0.920，具体情况见表2。

表2 10批怀牛膝药材特征图谱与对照特征图谱的相似度

2.2 QAMS法测定怀牛膝中的5-羟甲基糠醛、杯苋甾酮和β-蜕皮甾酮3种成分

2.2.1 线性关系 精密量取上述β-蜕皮甾酮、杯苋甾酮和5-羟甲基糠醛3种成分的对照品溶液,分别取样1、2、4、8、10、12μL,每个浓度测定3次，取平均值。以对照品浓度 (mg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标 (Y)，绘制标准曲线，以偏最小二乘法计算回归方程。具体情况见表3。

表3 3种怀牛膝药材成分的回归方程及线性范围

2.2.5 加样回收试验 取已知含量的怀牛膝1号样品粉末，精密称定，约0.50 g。分别精密称取相当于0.50 g 样品含量的对照品加入样品粉末中,按2.1.3“供试品溶液”项下的制备方法制备，采用上述建立的UPLC特征图谱法进样分析并计算,结果(见表4)显示：β-蜕皮甾酮、杯苋甾酮、5-羟甲基糠醛的平均加样回收率分别为 99.14 %、101.20 %、97.44 %，RSD 值分别为1.82 %、2.30 %、2.06 %，该方法的准确度较高。

表4 怀牛膝药材中待测成分加样回收率实验结果

2.2.6 怀牛膝中5-羟甲基糠醛、杯苋甾酮、β-蜕皮甾酮3种待测成分的RCF考察 根据RCF计算公式可得(Ws×Ai)/As= fs/i×Wi，公式中的As代表内参物峰面积，Ws代表内参物质量，Ai代表被测组分i峰面积，Wi代表被测组分i质量[13]，Wi对(Ws×Ai)/ As作回归曲线分析，斜率即RCF。本研究团队以怀牛膝中的主要活性成分β-蜕皮甾酮作内参物(s)，对6个质量点在线性关系考察项下经行测定，分别计算怀牛膝中杯苋甾酮(i1)、5-羟甲基糠醛(i2)与β-蜕皮甾酮(s)作内参物的fs/i1、fs/i2为0.7843、0.8136。

2.2.7 UPLC-QAMS法的耐用性评价 色谱柱、流速、柱温等3个方面可能是影响怀牛膝中5-羟甲基糠醛、杯苋甾酮、β-蜕皮甾酮3种成分RCF耐用性的主要因素，本实验研究重点考察了3种成分在2种不同型号的色谱柱(Waters BEH C18和WatersHSS T3)、3种不同流速(0.1、0.2、0.3 mL/min)和不同柱温 (25 °C、30 °C、35 °C)条件下对fs/i的影响。实验结果显示(见表5)，在2种不同型号的色谱柱条件下，5-羟甲基糠醛、杯苋甾酮与β-蜕皮甾酮之间的RCF的RSD值为1.1%～5.0%；在同种型号的色谱柱和不同流速条件下，5-羟甲基糠醛、杯苋甾酮与β-蜕皮甾酮之间的RCF的RSD分别为3.17%、3.53%、1.29% 和2.27%、0.79%、0.75%；在同种型号的色谱柱和不同柱温条件下，5-羟甲基糠醛、杯苋甾酮与β-蜕皮甾酮之间的RCF的RSD值分别为3.37%、1.33%、3.36% 和 0.97%、1.93%、1.11%；说明在上述3种有可能影响各成分RCF的重现性良好。

表5 不同色谱柱、不同流速、不同柱温测定相对校正因子

2.2.8 怀牛膝中5-羟甲基糠醛、杯苋甾酮、β-蜕皮甾酮3种待测组分色谱峰的定位 本实验研究主要采用待测成分(i)、内参物(s)之间的相对保留时间差(ris=tRi/tRs)和保留时间差(ΔtRis = tRi-tRs)2个参数，对怀牛膝中的待测组分色谱峰进行定位。实验研究结果显示(见表6)：ris值的波动在3种不同条件之间波动不明显，怀牛膝中β-蜕皮甾酮(s)、杯苋甾酮(i1)、5-羟甲基糠醛(i2)3中成分ris值的RSD值为0.28%～5.57%，说明上述方法对怀牛膝中3种待测组分色谱峰的定位是有效的、可行的、科学的。

表6 不同色谱柱、不同流速、不同柱温测定的相对保留值和保留时间差值

2.2.9 UPLC-QAMS 法与外标法测定结果的比较 采用上述所建立的UPLC-QAMS法，以测得的β-蜕皮甾酮为内参物(s)，对10批怀牛膝药材中的杯苋甾酮(i1)和5-羟甲基糠醛(i2)的含量进行测定；另采用外标法对同批样品成分含量进行测定。实验结果显示(见表7)：UPLC-QAMS 法与外标法方法测定的结果无明显差异，RSD值均<4%。

表7 一测多评与外标法测定10批怀牛膝中3种成分含量 mg/g

3 讨论

3.1 怀牛膝药材质量评价意义 怀牛膝中含有甾酮类、皂苷类、多糖类以及微量元素等多种成分，其中甾酮类是其发挥药理活性的主要成分[3]，而2020年版《中国药典》[2]关于牛膝质量标准仅收载了β-蜕皮甾酮一个指标性成分，本文在此基础上增加了杯苋甾酮、5-羟甲基糠醛2个指标性成分。现代药理实验研究表明其中的杯苋甾酮具有促进成骨样细胞增殖作用[8]，与怀牛膝临床上的补肝肾、强筋骨作用相吻合；怀牛膝在贮藏过程中容易泛糖变色，药用活性降低，刘振丽等[14-15]研究发现泛糖变成黑色怀牛膝中的5-羟甲基糠醛的含量高达正常怀牛膝含量的10倍。因此，增加杯苋甾酮、5-羟甲基糠醛2个指标性成分有益于对其品质评价与质量控制。

3.2 怀牛膝药材中QAMS定量检测参照成分的选择 β-蜕皮甾酮是2020版《中华人民共和国药典》控制牛膝质量评价的主要指标性成分，高纯度的对照品易得到，与外标法相比的比值在(97.83±0.71)%～(98.28±0.50)%，且计算其他成分的准确度又高，故本实验首选β-蜕皮甾酮作为怀牛膝药材中QAMS定量检测的参照成分。在缺少其他对照品的情况下，采用本文提供的相对校正因子及定位方法可以很好的实现利用一个对照品完成多个成分的含量测定。

3.3 采用相对保留值可对色谱峰准确定位 本实验研究结果显示，针对同一超高效液相色谱系统和同一品牌色谱柱，应用不同流速后，5-羟甲基糠醛、杯苋甾酮与β-蜕皮甾酮之间的相对保留值时间差的RSD分别为1.21%、0.98%、1.39% 和 0.95%、0.73%、1.05%；应用不同柱温后，5-羟甲基糠醛、杯苋甾酮与β-蜕皮甾酮之间的相对保留时间差的RSD值分别为1.26%、0.96%、0.59% 和 1.53%、1.02%、0.05%；应用不同色谱柱时，5-羟甲基糠醛、杯苋甾酮与β-蜕皮甾酮之间的相对保留时间差的RSD值分别为0.87%、0.95%和0.73%、0.92%，表明在此影响因素下各成分相对保留值的重现性良好；通过对色谱峰的定位研究发现，当所选参照峰的位置较为居中时，对另外2个组分峰的定位较为准确。因此，本文采用相对保留值可对色谱峰进行准确定位。

本实验研究建立的方法可实现对怀牛膝中的5-羟甲基糠醛、杯苋甾酮和β-蜕皮甾酮3种成分同步进行定性与定量研究，其测定计算的结果与外标法实测值无明显差异，重现性良好，简便省时，能科学有效的反应怀牛膝中其他有效活性成分的情况，提高了怀牛膝药材质量控制标准的水平。