黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠PI3K/AKT/HIF-1α 轴的影响

陈日裕

类风湿性关节炎是一种免疫性疾病,长期得不到有效的治疗还会导致机体功能丧失,一旦患病,患者会出现关节疼痛、肿胀等症状,对患者的生活和身体健康产生了极为不利的影响［1］。目前在临床中治疗类风湿性关节炎的主要药物依然是非幽体抗炎药和皮质激素,这两类药物对患者症状缓解和病情改善有一定的效果,但如果持续服用此类药物对患者身体会产生不利影响［2］。黑骨藤追风活络胶囊中使用的黑骨藤、清风藤、追风伞均来源于苗族的民间,有9 成以上的类风湿性关节炎患者经黑骨藤追风活络胶囊得到有效治疗。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 此次研究所用的药物包括由国药集团老来福(贵州)药业有限公司生产的黑骨藤追风活络胶囊。由上海碧云天生物技术有限公司生产的PI3K 抑制剂LY294002。大鼠每日给药黑骨藤追风活络胶囊的剂量计算与人体120 斤体重为准,给药量是人体一日服用药量的7 倍。

1.1.2 动物 选用雄性SD 大鼠,体重180～220 g,均来自于长沙天勤生物技术有限公司,饲养环境为SPF级,室内温度和湿度均按照标准调节。动物饲料统一来自长沙天勤生物技术有限公司。

1.1.3 试剂 此次实验选用的试剂包括：由Chond-rex公司生产的牛Ⅱ型胶原；由Sigma 公司生产的完全弗氏佐剂；由Abcam 公司生产的Bcl-2、Bax、HIF-1α、Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C、β-actin 蛋白；由CST 公司生产的p-AKT、p-PI3K 蛋白；由北京中杉金桥生物技术有限公司生产的山羊抗兔HRG 抗体；由上海碧云天生物技术有限公司生产的TUNEL 染色试剂盒；由欣博盛生物科技有限公司生产的IL-2、IL-4、IL-17 ELISA 试剂盒；由北京索莱宝生物科技有限公司生产的SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 类风湿关节炎大鼠造模 选用雄性SD 大鼠若干,随机分为空白组和造模组,将牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂配制成混合悬液,造模组大鼠在实验前1 天和第7 天分别于尾巴根部位置经皮下注射该悬液,让大鼠患类风湿关节炎。诱发类风湿性关节炎后,观察大鼠足趾关节肿胀情况,并对其肿胀程度进行评分,大鼠的足踢趾均有轻微肿胀为1 分；大鼠的足踢趾均有较为明显的肿胀为2 分；大鼠的足踢趾肿胀严重为3 分；大鼠的足踢趾、踩关节均肿胀严重或发生变形为4 分。肿胀评分为2、3、4 分的大鼠表示造模成功。造模成功的大鼠随机分为3 组,分别为模型组、黑骨藤追风活络胶囊组以及黑骨藤追风活络胶囊联合PI3K 抑制剂给药组,每组分得大鼠8 只。空白组大鼠按照其身体重量每日灌胃生理盐水,模型组、胶囊组、联合给药组每日灌胃给药羧甲基纤维素钠配制的混悬液,胶囊组应用黑骨藤追风活络胶囊,黑骨藤追风活络胶囊联合PI3K 抑制剂给药组应用黑骨藤追风活络胶囊与PI3K 抑制剂,各组均持续5 周。最后一次给药后对各组大鼠的足跖部厚度进行测量,于大鼠腹部主动脉采取储存,取适量脾脏置于4%多聚甲醛,其余脾脏置于-80℃环境下储存,同侧关节滑膜组织以同样的方式储存。

1.2.2 后肢足踢部肿胀度测量 经厚度测量仪对炎症诱导前后大鼠两只后肢足踢部肿胀程度进行测量,并做好详细登记,根据等级结果做进一步分析。

1.2.3 蛋白定量 采用BCA 蛋白定量法完成蛋白定量,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶完成浓缩胶和分离胶制备,分别为5%和12%,加入样品之后在80 V 电压条件下电泳,持续2 h,60 V 电压条件下转膜,持续2 h,将5%脱脂奶粉在封闭储存2 h,然后加入第一抗体,内参一抗浓度为1∶8000,其余为1∶1500,用TBST 缓冲液冲洗3 次,加入浓度为1∶7000 的第二抗体,再次冲洗,置入显影液,利用ImagePro-Plus6.0 软件对结果进行分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠治疗后不同时期的足踢趾炎性肿胀程度对比 治疗前,模型组、黑骨藤追风活络胶囊组、黑骨藤追风活络胶囊联合PI3K 抑制剂给药组的足踢趾肿胀程度均高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗后1、2、3、4、5 周,黑骨藤追风活络胶囊组、黑骨藤追风活络胶囊联合PI3K 抑制剂给药组的足踢趾肿胀程度均低于本组治疗前,且均低于模型组,差异均具有统计学意义(P<0.05),但仍不及空白组。见表1。

2.2 四组大鼠的脾脏Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表达对比 模型组大鼠的脾脏Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表达显著高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。但是黑骨藤追风活络胶囊组和黑骨藤追风活络胶囊联合PI3K抑制剂给药组大鼠的脾脏Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表达低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 四组大鼠滑膜组织p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表达对比 模型组大鼠的滑膜组织p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表达显著高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。黑骨藤追风活络胶囊组及黑骨藤追风活络胶囊联合PI3K 抑制剂给药组大鼠的滑膜组织p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bcl-2 蛋白表达明显低于模型组,而Bax 蛋白表达明显高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表1 四组大鼠治疗后不同时期的足踢趾炎性肿胀程度对比(,mm)

表1 四组大鼠治疗后不同时期的足踢趾炎性肿胀程度对比(,mm)

注：与模型组对比,aP<0.05

表2 四组大鼠的脾脏Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表达对比()

表2 四组大鼠的脾脏Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表达对比()

注：与空白组对比,aP<0.05；与模型组对比,bP<0.05

表3 黑骨藤追风活络胶囊在不同时期对类风湿关节炎大鼠滑膜组织p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响()

表3 黑骨藤追风活络胶囊在不同时期对类风湿关节炎大鼠滑膜组织p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响()

注：与空白组对比,aP<0.05；与模型组对比,bP<0.05

3 讨论

黑骨藤追风活络胶囊由贵州同济堂制药有限公司生产,且为该公司的专利药物,主要功效是活血通络、祛风止痛等,但是针对类风湿关节炎的临床治疗机制尚无明确定论［3］。该胶囊中含有黑骨藤、清风藤、追风伞,其中黑骨藤的功效为祛风湿、通经络、活血消炎,对风湿关节痛、跌打损伤、乳腺炎、口腔炎等有良好的治疗效果；清风藤的功效为通经络、祛风湿、利尿,对关节肿胀、风湿痹症、水肿、麻痹瘙痒、脚气等有良好的治疗效果；追分伞的功效为活血止痛、祛风通络［4］。对风湿麻痹、半身不遂、四肢拘挛、骨折、跌扑、小儿惊风等有良好的治疗效果。相关文献也曾对黑骨藤追风活络胶囊的用药安全性提出质疑,认为其有一定的毒副作用［5］。引发类风湿关节炎的因素主要是PI3K-AKT-HIF-1α 信号通路,激活PI3K 蛋白的细胞因子不仅仅局限于一种,可促进细胞分化、加强代谢和细胞活力、诱发炎症甚至癌症。AKT 蛋白曾经是胰岛素细胞信号的存在,可以反应细胞生长、细胞增殖等情况,并于PI3K 蛋白下游激活,引发一些列蛋白反应［6］。HIF-1α 不受组织损伤影响,以含氧量为依据完成营养供应和血管增生,快速反应机体供养状况。针对炎症、血氧含量不足的疾病中,HIF-1α 无法正常完成降解,经转移后结合HIF-1β,最终形成二聚体,激活下游蛋白,帮助新生血管生成［7］。

大鼠造模完成后,相较于空白组,模型组大鼠的足跖部炎性肿胀程度严重,胶囊组大鼠经黑骨藤追风活络胶囊治疗后,足跖部炎性肿胀情况得到明显缓解,联合给药组大鼠经黑骨藤追风活络胶囊联合PI3K 抑制剂治疗后,二者的协同作用得到有效的发挥,让炎症难以进一步加重。模型组大鼠的脾脏Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表达显著高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。但是黑骨藤追风活络胶囊组和黑骨藤追风活络胶囊联合PI3K 抑制剂给药组大鼠的脾脏Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表达低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠的滑膜组织p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表达显著高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。黑骨藤追风活络胶囊组及黑骨藤追风活络胶囊联合PI3K 抑制剂给药组大鼠的滑膜组织p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bcl-2 蛋白表达明显低于模型组,而Bax 蛋白表达明显高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明,黑骨藤追风活络胶囊以及黑骨藤追风活络胶囊联合PI3K 抑制剂治疗类风湿关节炎的肿胀问题虽然有一定的效果,但是无法根治。黑骨藤追风活络胶囊以及黑骨藤追风活络胶囊联合PI3K 抑制剂可有效降低脾脏Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表达,让大鼠的滑膜细胞加速凋亡。

综上所述,黑骨藤追风活络胶囊可影响类风湿关节炎中PI3K/AKT/HIF-1α 信号通路的表达,引发多种细胞和蛋白调节。