四逆汤对阿霉素诱导的慢性心力衰竭大鼠内质网应激的影响

于游， 杜莹， 南明花， 李佳， 张妤， 吕美君， 王莹， 吴瑾， 孙红

（1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属第二医院，辽宁沈阳 110034）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多种心血管疾病的终末阶段，具有较高死亡率。对心力衰竭机制的研究始终是心血管领域研究的重要内容。近年来，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是CHF 机制和治疗靶点[1]研究的热点，氧化应激、钙稳态失衡、缺血等各种因素刺激均可导致ERS 的发生。目前针对CHF 患者暂无根治措施，临床主要以对症治疗、改善心功能和提高生活质量为主[2]。四逆汤为中医回阳救逆的代表方剂，现代研究表明，其具有强心、保护心肌、保护血管、免疫调节及抗休克等作用[3]，且对心血管疾病的治疗作用在临床中也得到证实[4]。本研究通过腹腔注射阿霉素的方法建立CHF大鼠模型，观察四逆汤对阿霉素诱导的CHF 大鼠ERS 的影响，探讨四逆汤治疗CHF 的分子机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物及饲养方法 SPF级12周龄健康雄性SD大鼠90 只，体质量（220±20）g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，动物质量合格证号：SCXK（辽）2015-0001。饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，自由进食饮水。动物饲养及实验方案遵循国家《实验动物管理条例》并通过辽宁中医药大学伦理委员会审查。

1.2 药物、试剂与仪器 四逆汤的中药组成：附子10 g、干姜6 g、炙甘草4 g。以上中药材颗粒购自辽宁中医药大学附属医院，由江阴天江药业有限公司生产（批号分别为18110511、18101401、19010031），每装0.5 g，相当于饮片3 g。盐酸曲美他嗪片（万爽力），20 mg/片，由施维雅（天津）制药有限公司生产（国药准字H20055465，批号：2014557）。盐酸阿霉素，25 mg/支，北京索莱宝科技有限公司生产，批号：1114H022；大鼠脑钠肽（BNP）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）酶联免疫吸附分析（ELISA）检测试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司；SYBR Green Master Mix荧光定量聚合酶链反应（PCR）试剂盒由大连TaKaRa 公司提供（批号：DRR047A）；TRIzol 试剂由大连TaKaRa 公司提供（批号：DRR820A）。7500实时荧光定量PCR仪（美国Life 公司）；Vevo2100 超高分辨率小动物超声影像系统（加拿大VisualSonics公司）；SpectraMaxi3多功能酶标仪（美国MD公司）；ST16R型冷冻高速离心机、 Wellwash Versa 多功能高效洗板机、Nano2000 超微量紫外分光光度计（德国Thermo 公司）。

1.3 动物分组、模型制备与给药 取90只大鼠适应性喂养1 周后，随机选取15 只作为正常组，其余大鼠腹腔注射阿霉素（浓度2 mg/mL）2 mL/kg，每周1次，共6周，制备CHF模型[5-6]，同期正常组给予腹腔注射等体积生理盐水。造模结束后，正常组大鼠全部存活，造模大鼠存活60只。再将60只CHF大鼠按随机数字表分为5组，即模型组，四逆汤低、中、高剂量组，曲美他嗪组，每组12 只。四逆汤低、中、高剂量组按包装上推荐的每克颗粒折算成的饮片量来调配每种药物，根据人与动物等效关系[7]分别给予1.4、4.2、12.6（生药）g·kg-1·d-1灌胃，容积均为2 mL/只；曲美他嗪组根据人与动物等效关系[7]给予曲美他嗪10 mg·kg-1·d-1灌胃；正常组和模型组给予相同体积的生理盐水灌胃。连续给药4周。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 心功能检测 将大鼠诱导麻醉后，将鼻子置于鼻套中，吸入体积分数2%异氟烷气（异氟烷∶氧气=2∶1），仰卧位固定。待翻正反射消失，用脱毛膏胸部脱毛备皮，涂耦合剂，将小动物超声探头（250 MHz）置于大鼠左前胸，进行超声检查。测量左心室舒张末期直径（LVEDD）、左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS）。

1.4.2 血浆BNP和AngⅡ检测 大鼠末次给药后，禁食12 h，于次日给予100 g/L水合氯醛3 ～4 mL/kg麻醉，腹主动脉取血，肝素抗凝，静置1 h，以3 000 r/min 离心20 min，分离上清，采用ELISA 法检测BNP和AngⅡ的含量，具体步骤按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.4.3 实时PCR法检测心肌组织葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、RNA 依赖的蛋白激酶样内质网激酶（PERK）及活化转录因子4（ATF4）mRNA 表达 应用Premier 5.0 软件设计PCR 引物，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。GRP78 上游引物序列为5’-TAATCAGCCCACCGTAAC-3’，下游引物序列为5’-GTTTCCTGTCCCTTTGTC-3’，扩增长度193 bp；PERK 上游引物序列为5’-CTCAGTGCATATAGTG GAAA-3’，下游引物序列为5’-ATGTCTGGAATA TACCGAAG-3’，扩增长度203 bp；ATF4 上游引物序列为5’-ATGACCGAAATGAGCTTCCTG-3’，下游引物序列为5’-GCTGGAGAACCCATGAGGT-3’，扩增153 bp；GAPDH 上游引物序列为5’-GT CGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物序列为5’-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3’，扩增长度181 bp。取心肌组织，用TRIzol 提取总RNA，逆转录，设定PCR 反应条件，初始变性（95 ℃，3 min），进行PCR 反应，进而进行40 个循环的变性（95 ℃，15 s）、退火（60 ℃，30 s）和延伸（72 ℃，30 s）。重复检测3次。采用2-△△CT法对待测基因进行相对定量分析。

1.5 统计方法 采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。先行正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布采用单因素方差分析进行组间比较，不符合正态分布则采用非参数检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模大鼠一般状态观察 造模大鼠存活率为66.7%。观察发现，应用阿霉素造模第3周后，大鼠陆续出现精神萎靡，进食、进水量减少，活动量下降，体质量增长缓慢或下降，腹水，口唇及足趾发绀等CHF的症状。

2.2 各组大鼠心功能比较 表1 结果显示：与正常组比较，模型组大鼠左心功能明显降低，表现为LVEDD 显著增大，LVEF、LVFS 均显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.01）；与模型组比较，各治疗组LVEDD 降低，LVEF、LVFS 增加，其中，四逆汤高剂量组及曲美他嗪组LVEDD、LVEF的差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01），四逆汤中、高剂量组及曲美他嗪组LVFS的差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01），且四逆汤各剂量组LVEDD、LVFS、LVEF 与曲美他嗪组比较，差异均无统计学意义（P ＞0.05）。

2.3 各组大鼠血浆BNP 和AngⅡ水平比较 表2结果显示：与正常组比较，模型组血浆BNP和AngⅡ含量升高（P＜0.01）；与模型组比较，各治疗组血浆BNP和AngⅡ含量均有不同程度降低，其中，四逆汤中、高剂量组及曲美他嗪组差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01），且四逆汤各剂量组BNP、AngⅡ含量与曲美他嗪组比较，差异均无统计学意义（P ＞0.05）。

表1 各组大鼠心功能比较Table 1 Comparison of the heart function in various groups （±s）

表1 各组大鼠心功能比较Table 1 Comparison of the heart function in various groups （±s）

①P ＜0.01，与正常组比较；②P ＜0.05，③P ＜0.01与模型组比较，

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表2 各组大鼠血浆BNP和AngⅡ水平比较Table 2 Comparison of the plasma BNP and AngⅡlevels in various groups （±s，pg·mL-1）

表2 各组大鼠血浆BNP和AngⅡ水平比较Table 2 Comparison of the plasma BNP and AngⅡlevels in various groups （±s，pg·mL-1）

①P ＜0.01，与正常组比较；②P ＜0.05，③P ＜0.01，与模型组比较

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2.4 各组大鼠心肌组织GRP78、PERK、ATF4 mRNA表达水平比较 图1结果显示：与正常组比较，模型组大鼠心肌组织GRP78、PERK、ATF4 mRNA 表达量升高（P ＜0.01）；与模型组比较，各治疗组心肌组织GRP78、PERK、ATF4 mRNA表达量降低，其中，四逆汤中、高剂量组及曲美他嗪组GRP78 的差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01），四逆汤高剂量组及曲美他嗪组PERK、ATF4 的差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01），且四逆汤各剂量组GRP78、PERK、ATF4 mRNA表达水平与曲美他嗪组比较，差异均无统计学意义（P ＞0.05）。

3 讨论

慢性心力衰竭（CHF）是各种心血管疾病发展的终末阶段。近年来，研究CHF 的动物模型较多，如药物所致心肌病模型、压力超负荷模型等。阿霉素是一种高效、广谱蒽醌类抗肿瘤药物，常用于治疗白血病、淋巴瘤等疾病，但由于明显的心脏毒性，长期大量使用会引起充血性心力衰竭[8]，因此，在研究中经常选用阿霉素注射来制备心力衰竭模型[9]。与其他方法比较，此造模方法具有操作简单、死亡率较低、成模率相对较高等特点。本研究选用腹腔注射阿霉素来诱导CHF模型，3周后，发现模型组大鼠精神萎靡，心功能减低，并在神经内分泌系统等方面表现出对心肌的毒害，表明模型建立成功。

图1 各组大鼠心肌组织GRP78、PERK及ATF4 mRNA表达水平比较Figure 1 Comparison of the mRNA expression levels of GRP78，PERK，ATF4 in cardiac muscle tissue of various groups（±s）

发生心力衰竭时，左室充盈压和室壁张力的增高是引起BNP分泌增加的关键原因。前期研究[10]已证实，心力衰竭的严重程度与BNP 水平呈正相关。肾素-血管紧张素-醛固酮（RAAS）系统是人体神经内分泌系统中的重要组成部分，其生物学效应主要是通过AngⅡ来实现[11]。正常条件下，AngⅡ有维持血管张力，兴奋交感神经的作用；在病理情况下，AngⅡ是导致心室重构的主要因素。本研究发现，模型组大鼠BNP和AngⅡ水平均升高，提示BNP和AngⅡ可以作为观察心力衰竭严重程度的标志物之一。

已有越来越多的研究证据表明，ERS在多种心血管疾病的病理过程中起着重要的作用，如动脉粥样硬化、缺血/再灌注损伤、缺血性心脏病等[12]。适度的ERS是细胞的一种自我保护机制，可修复内质网稳态，而严重或持续的ERS 则诱导促凋亡因子的表达和活化，从而介导心肌细胞的凋亡[13]。动物实验和临床研究表明，ERS启动了细胞凋亡并参与CHF 的病理生理过程[14]。内质网分子伴侣GRP78 属于内质网稳态的感受器，是ERS 的标志性蛋白[15]，过度的ERS会启动内质网膜上3种跨膜蛋白（跨膜蛋白激酶1、双链RNA 依赖的PERK和活化转录因子6）介导的3条信号通路诱导细胞凋亡。PERK 通路是内质网应激的最重要通路，同时也是ERS 发生时最先启动的通路[16]。PERK/ATF4 通路是内质网应激时发挥关键作用的通路，在许多慢性疾病的发生过程中起着尤为重要的作用[17]。ERS 状态时，GRP78 从PERK 上解离并且大量表达，PERK通过自身磷酸化，进一步激活下游一系列反应同时上调ATF4，进而激活生长停滞及损伤基因诱导细胞凋亡[18]，从而导致CHF的发生。本研究结果显示，CHF 模型大鼠心肌组织中与内质网应激相关的GRP78、PERK 及ATF4的mRNA 表达量显著增多，表明CHF 的发生与ERS的PERK通路有关。

中医学并无“心力衰竭”病名，临床上将其归属于“心悸”“水肿”“喘证”等范畴。本病多因心气或心阳虚衰，气血津液运行不畅，导致痰浊、血瘀、水饮互结为病。中药具有多组分、多途径、多环节和多靶点的特点，在CHF 治疗与控制进展上具有独特的优势。四逆汤出自张仲景《伤寒论》，原文记载：“脉浮而迟，表热里寒，下利清谷者，四逆汤主之。”该方由附子、干姜和甘草3味中药组成，用于少阴病之四肢厥逆、脉沉微细、神疲欲寐、恶寒倦卧及腹痛下利等阳气虚衰诸症[19]，为回阳救逆之代表方剂。方中：附子大辛大热，温肾壮阳，回阳救逆，其性走而不守，为君药；干姜守而不走，温中散寒，与附子相配，一走一守，加强破阴复阳之功，属臣药；伍以炙甘草，一方面可益气温中，调和诸药，另一方面制约附子、干姜劫阴之弊，以防迅发而致虚阳暴脱，为佐使药。三药相合，扬长避短，共奏回阳救逆之效。现代药理研究也证实，三药单味均有保护心肌细胞改善心功能的作用[20-21]，尤其附子，具有增强心肌收缩力、增加冠脉血流量、抗心肌缺血和抗休克等效应[22]。本研究结果显示，经四逆汤或曲美他嗪治疗后，阿霉素诱导的CHF 大鼠心功能、BNP和AngⅡ水平均明显改善，心肌组织中与内质网应激相关的GRP78、PERK 及ATF4 的mRNA表达量显著降低，且2药治疗效果无明显差异，表明四逆汤可有效改善大鼠CHF，其机制可能与抑制内质网应激PERK/ATF4通路有关。

综上所述，本研究结果在一定程度上说明心力衰竭时会出现ERS 反应，四逆汤可抑制ERS 诱导的相关通路，增强内质网蛋白折叠能力，调节内质网稳态，从而发挥抗心力衰竭的作用，可为中药发现预防和治疗心力衰竭的新靶点提供参考和依据。