锰渣-土壤混合基质上黑麦草和紫花苜蓿生长状况及其对锰的累积特征

敖 慧，刘 方,，朱 健,，陈祖拥

（1. 贵州大学资源与环境工程学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州喀斯特环境生态系统教育部野外科学观测研究站，贵州 贵阳 550025）

金属锰是一种重要的冶金、化工原材料，生产企业主要分布在贵州松桃、湖南花垣、重庆秀山等“锰三角”地区。我国锰生产主要以电解工艺为主，碳酸锰矿直接利用硫酸与碳酸锰化合反应制取硫酸锰溶液，经加入添加剂如二氧化硒、亚硫酸铵等后进入电解槽进行电解，在电解锰生产过程中会产生大量的浸出渣、除铁渣、硫化渣等[1]，这些废渣酸性较强，含有氮、磷、钾等植物生长需要的营养元素，但也含了大量的锰(Mn)、铬(Cd)、砷(As)、铬(Cr)等重金属元素，露天堆放的电解锰渣在降水的作用下，容易造成堆场周围土壤及水体的严重污染[2-3]。

为了降低电解锰渣中有害元素在环境中的迁移，利用植物对其吸收、固定是当前土壤修复最常用的方法，针对性地选择适应能力强的植物类型是电解锰渣堆场生态修复的重要前提。黑麦草(Lolium perenne)是常见的多年生冷季型草坪草，其生长速度快、生物量大，对重金属污染的土壤具有较强的适应能力，王加真等[4]的研究结果表明，黑麦草对电解锰渣浸出液具有一定的耐性，当浸出液浓度低于3%时，黑麦草均能正常生长；张永兰和王友保[5]采用多年生黑麦草对覆土作用下铜尾矿的修复，发现多年生黑麦草在铜尾矿基质中能较好生长。此外，紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种产量高、生长周期较短的豆科牧草，对铜(Cu)、锌(Zn)、镉(Cd)、铅(Pb)也具有较好的吸收能力[6]，朱剑飞等[7]研究了紫花苜蓿、狼尾草(P. americanum)和黑麦草对Cu和Pb 复合污染土壤的修复能力，表明紫花苜蓿和黑麦草对Pb 均具有较强的富集能力。但是，目前对Mn 胁迫下紫花苜蓿和黑麦草生长变化方面的研究还较少，Mn 是植物生长的必需元素，适量的Mn有利于叶绿素的合成，但是锰过量会抑制植物根系对钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)等元素的吸收，引起活性氧过量导致植物细胞氧化损伤，使叶绿体结构破坏、叶绿素含量下降[8]。因此，本研究通过在土壤中添加不同比例的电解锰渣，探讨锰污染土壤上紫花苜蓿和黑麦草生长的响应及其对Mn 的累积特征，为锰渣堆场的生态修复提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

电解锰渣(electrolytic manganese residue, EMR)：采自贵州铜仁松桃县某电解锰厂；供试土壤，为碳酸岩发育的石灰性土壤。将采集的样品在实验室自然风干过筛后保存备用。供试草种，分别为多年生黑麦草和紫花苜蓿。电解锰渣是电解锰过程产生的酸性废渣，其pH 为4.89，含有较丰富的营养成分，有效磷含量49.24 mg·kg-1，速效钾含量269.85 mg·kg-1，碱解氮含量1 876 mg·kg-1，有机质含量70.50 g·kg-1，NH3-N 含量为119.20 mg·kg-1。但也含有大量的有毒有害重金属，其中，Mn、Cu、Zn、Cr、镍(Ni)、As、Cd、Pb 含量分别为19 555、75.6、197.3、197.3、58.8、46.8、1.65 和71.7 mg·kg-1。

1.2 试验设计

试验于2020 年7 月8 日-9 月8 日在贵州大学资源与环境工程学院大棚内进行，试验设置5 个处理，每个处理设置3 次重复。即电解锰渣添加量依次为7%、14%、21%、28% 和35%，以不添加锰渣为对照，每个盆栽锰渣-土壤混合基质为1 000 g，用精确度为0.1 g 的天平按照比例称取供试土壤和锰渣，渣-土混合基质的理化性质如表1 所列，混合均匀后装入直径15 cm、高10 cm 的盆内。挑选饱满、大小均一的草种，清洗过后用吸水纸吸干表面的水分，每盆播种150 粒，7 月8 日到7 月15 日记录每天的发芽情况。

表 1 锰渣-土壤混合基质的理化性质Table 1 Physicochemical properties of the mixed soil matrix of electrolytic manganese residue

1.3 指标测定

pH：按照水土比25 ∶ 10，即称取10 g 基质，加入25 mL 蒸馏水，搅拌10 min，并静置30 min，浸提液经平衡后用pH 计测定。发芽指标：以幼芽露出土壤表面为准，统计前7 d 种子的发芽情况。然后计算发芽率、发芽势、发芽指数。株高与生物量(地上部)：盆栽培养周期为2 个月，生长结束后，随机挑选20 株测量其从地面到植株顶点的拉伸后的株高，取平均值代表植物的株高，用万分之一的天平称量每个盆栽的总生物量。光合色素采用95% 乙醇提取，然后分别在波长665、649、470 nm 下测定吸光度，叶绿素a (Ca) = 13.95 A665- 6.88 A649，叶绿素b(Cb) = 24.96 A649- 7.32 A665，类胡萝卜素含量 = (1 000 A470- 2.05 Ca- 114.8 Cb)/245。丙二醛(malonaldehyde，MDA)采用硫代巴比妥酸显色法测定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)采用氮蓝四唑法测定；过氧化氢酶(catalase，CAT) 采用高锰酸钾滴定法测定；过氧化物酶(peroxidase，POD) 采用愈创木酚显色法测定[9-10]。土壤和植物Mn 全量：土壤采用HNO3-HF-HClO4高压消解，植物采用HNO3-HClO4消煮，然后用原子吸收光谱仪进行Mn 含量测定。

1.4 数据处理

用Excel 进行数据的统计并计算平均值与标准差，发芽率 = 第7 天发芽粒数/供试种子总数 × 100%；发芽势 ∑= 第4 天发芽粒数/供试种子数 × 100%；发芽指数 = (Gt/Dt)，Gt为第t 天的发芽粒数，Dt为相应的发芽天数。生物富集系数(biological concentration factor, BCF)和转移系数(translocation factor, TF)通常用来评估植物对重金属的富集能力，BCF = 植物中重金属含量/土壤中重金属含量，TF = 植物地上部分重金属含量/植物根系重金属含量。然后采用SPSS 22.0 进行数据的差异显著性分析，用Origin 进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 锰渣添加量对紫花苜蓿、黑麦草发芽及生长情况的影响

随着锰渣添加量的增加，紫花苜蓿、黑麦草的发芽势、发芽率和发芽指数均出现明显的下降(表2)，与对照相比，紫花苜蓿发芽势依次下降了7.9%、49.2%、73.2%、91.6%和98.9%，发芽率依次下降了2.0%、7.1%、39.3%、64.3% 和73.0%，发芽指数依次下降了6.5%、28.4%、59.7%、80.3%和86.4%；而黑麦草的发芽势依次下降了34.9%、39.5%、70.3%、79.1%和93.0%，发芽率依次下降了6.9%、17.6%、25.2%、28.2%和45.0%，发芽指数依次下降了18.0%、27.5%、43.5%、46.1%和62.5%，这表明电解锰渣对黑麦草、紫花苜蓿种子的萌发产生了抑制作用，特别是锰渣添加量大于14%时，两种植物的发芽势、发芽率和发芽指数均出现显著性降低(P ＜ 0.05)。

表 2 不同锰渣-土壤混合基质上紫花苜蓿、黑麦草的生长情况Table 2 Growth of Medicago sativa and Lolium perenne in different EMR-soil mixed matrices

紫花苜蓿、黑麦草的株高均随着锰渣添加出现不同程度的增加(表2)，但是总生物量呈现出先增加后降低的趋势。土壤添加锰渣后紫花苜蓿的株高明显的大于对照，当锰渣添加量为21%时，紫花苜蓿的株高达到最大，比对照显著增加了58.5%；在锰渣添加量为14%时，紫花苜蓿的总生物量达到最大值，比对照显著提高了198%，在锰渣添加量大于28%时，紫花苜蓿的总生物量显著低于对照，较对照分别减少了30.1%和63.2%。对黑麦草来说，添加锰渣能明显促进黑麦草的生长，黑麦草的株高与对照相比依次增加了45.0%、53.9%、88.2%、124.3%和100%，与对照差异显著(P ＜ 0.05)；在锰渣添加量为21%时，黑麦草的总生物量达到最大值，比对照显著增加了150.5%，在锰渣添加量为35%时，黑麦草的总生物量达到最小，比对照显著降低了29.2%。可见，锰渣添加后为植物提供了养分，从而促进紫花苜蓿、黑麦草的生长，特别是黑麦草，但是高量的锰渣会显著降低植物的总生物量。

2.2 锰渣添加量对紫花苜蓿、黑麦草光合色素的影响

高等植物中光合色素可分为叶绿素和类胡萝卜素，随着锰渣添加量的增加紫花苜蓿的叶绿素和类胡萝卜素含量均呈现先增加后降低的趋势(图1)，在锰渣添加量为7%和14%的处理中紫花苜蓿的叶绿素含量显著高于除锰添加量为21%外的其他处理(P ＜ 0.05)，当锰渣添加量在14%时紫花苜蓿的叶绿素含量达到最大值，比对照高出59.67%；锰渣添加量增加到28%和35%时，紫花苜蓿的叶绿素含量降低，相比对照依次下降1.50%和5.70%。在锰渣添加量为14%时紫花苜蓿的类胡萝卜素含量达到最大，比对照高出28.0%；随着锰渣量继续增加，紫花苜蓿的类胡萝卜素逐渐降低，但各处理与对照的差异未达到显著性水平。由此可知，低添加量锰渣促进了紫花苜蓿光合色素合成，但是锰渣添加量过高时，则会产生一定的抑制作用。

图 1 不同锰渣添加量对紫花苜蓿、黑麦草光合色素的影响Figure 1 Effects of different EMR additions on photosynthetic pigments of Medicago sativa and Lolium perenne

黑麦草的叶绿素和类胡萝卜素含量随着锰渣添加量的增加均出现不同程度的增加，添加锰渣后，黑麦草的叶绿素和类胡萝卜素含量均高于对照，在锰渣添加量为14%和21%时，黑麦草的叶绿素含量和类胡萝卜素含量均显著高于对照(P ＜ 0.05)。叶绿素含量在14%时达到最大，相比对照高出34.8%；类胡萝卜素含量在21%时达到最高，相比对照高出48.0%，说明添加锰渣对黑麦草光合色素的合成起到明显的促进作用。

2.3 锰渣添加量对紫花苜蓿、黑麦草丙二醛和抗氧化酶的影响

随着锰渣添加量的增加，紫花苜蓿的MDA 含量表现出增加的趋势(图2)。紫花苜蓿在锰渣添加量为7% 和14% 的处理中，其MDA 含量均显著低于对照(P ＜ 0.05)，依次比对照低27.8%和35.0%；当锰渣添加量增加到21%、28%和35%后，紫花苜蓿的MDA 含量显著增加(P ＜ 0.05)，低添加量锰渣降低了紫花苜蓿的MDA 含量，高含量的锰渣反之，这表明少量的锰渣对紫花苜蓿的生长没有产生胁迫，而大量的锰渣则会导致植物中活性氧过量，使得MDA 含量显著增加。但是，土壤添加7%、14%、21%、28%和35% 的锰渣后黑麦草MDA 含量均出现下降，依次比对照降低39.76%、28.72%、47.98%、50.03%和34.03%，尤其是在锰渣量为21% 和28% 时显著低于对照(P ＜ 0.05)，表明锰渣添加后没有对黑麦草产生氧化胁迫，反而降低了体内的活性氧，缓解植物细胞膜脂过氧化。由此可知，同一处理下紫花苜蓿的MDA 含量高于黑麦草，说明紫花苜蓿受到的氧化胁迫程度比黑麦草高。

添加锰渣后，紫花苜蓿的SOD 活性均高于对照(图2)，在锰渣量为28%时达到最高，显著高于对照(P ＜ 0.05)。紫花苜蓿的CAT 活性在锰渣添加量为7%时最低；在锰渣量为28%时达到最高，显著高于对照(P ＜ 0.05)。当锰渣添加量为7%、14%时，紫花苜蓿的POD 活性低于对照，依次较对照降低11.0%和8.0%，但锰渣添加量为35%时紫花苜蓿的POD 活性达到最大值，显著高于对照(P ＜ 0.05)；可见，添加少量的锰渣能够降低紫花苜蓿的CAT、POD活性，而过量的锰渣会刺激抗氧化酶系统，使得CAT、POD 活性增加。对黑麦草来说，随着锰渣添加量的增加黑麦草的SOD、POD 活性先增加后降低，但是变化幅度均比较小，在锰渣添加量为7%时，黑麦草的SOD 活性最低，较对照显著降低29.53%，而POD活性在锰渣添加量为28%的处理时达到最低，较对照降低50.25%。锰渣添加后黑麦草的CAT 活性随着锰渣添加逐渐升高，但均低于对照，添加锰渣后，黑麦草的SOD、POD、CAT活性比对照均出现不同程度降低。可见，土壤添加锰渣后反而降低了黑麦草的抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性，这说明锰渣添加没有对黑麦草产生氧化胁迫，但当锰渣添加量大于14%时开始对紫花苜蓿产生胁迫，说明在锰渣-土壤混合基质上黑麦草的耐受性比紫花苜蓿强。

2.4 锰渣添加量对紫花苜蓿、黑麦草植株累积锰的影响

图 2 不同锰渣添加量对植物MDA 含量、POD、SOD、CAT 活性的影响Figure 2 Effects of different EMR additions on MDA content and POD, SOD, and CAT activities in plants

紫花苜蓿、黑麦草中锰的含量均随着锰渣添加量的增加而增加(表3)。与对照相比，紫花苜蓿地上部分的锰含量依次增加了42.2%、92.1%、220.1%、1 404.4%和3 810.1%，根系的锰含量依次增加了63.4%、89.1%、384.5%、2 823.5%和8 583.4%，在锰渣添加量为35%时，地上部分锰含量和根系锰含量均达到最大，与对照差异显著(P ＜ 0.05)；黑麦草地上部分的锰含量依次增加了79.2%、111.2%、305.2%、897.1%和1 377.4%，根系的锰含量依次增加了211.5%、347.2%、1 306.8%、8 174.0%和10 606.0%，均在锰渣添加量为35%时最大。总体来说，黑麦草中锰含量大于紫花苜蓿，两种植物根系的锰含量均大于地上部分，由此可见，紫花苜蓿和黑麦草都主要是通过根系累积锰，且黑麦草的累积量大于紫花苜蓿。

紫花苜蓿和黑麦草的富集系数随着锰渣添加量的增加而增加(表3)，且根系的富集系数大于地上部分的富集系数，说明根系的富集能力比地上部分强。在锰渣添加量为35%时，紫花苜蓿和黑麦草地上部分和根系的富集系数均最大，紫花苜蓿的地上部分和根系的富集系数分别为0.29 和1.02，分别比对照高314.3% 和827.3%；黑麦草地上部分和根系的富集系数分别为0.23 和1.75，分别比对照高96.7%和1 358.3%，黑麦草根系的富集系数明显大于紫花苜蓿，说明黑麦草根系对锰的累积能力比紫花苜蓿强，而地上部分的富集系数在锰渣添加量为35%时是紫花苜蓿大于黑麦草，说明在高锰含量的基质中，紫花苜蓿地上部分的锰富集能力大于黑麦草。同一处理中紫花苜蓿的转移系数为0.29～0.65，黑麦草的转移系数为0.12～0.95，说明紫花苜蓿对锰的转移能力比黑麦草强。紫花苜蓿和黑麦草的转移系数随着锰渣添加均呈现出减小的趋势，说明锰渣添加量越高，植物对锰的转移能力越弱。

3 讨论

3.1 土壤中电解锰渣对黑麦草和紫花苜蓿的生长的影响

由于电解锰渣酸性较强、重金属全量及有效态含量高，会对种子萌发产生抑制作用[11]，锰渣添加后导致基质的pH 下降，使得紫花苜蓿、黑麦草的发芽率都出现明显降低，并且锰胁迫环境下种子内部储存物质的分解及转化受到抑制，进而影响种子萌发[12]。但是添加少量锰渣可以促进植物生长，通过本研究可以知道，添加锰渣后，黑麦草和紫花苜蓿的株高都高于对照，但是锰渣添加量过高会导致植物总生物量降低，当锰渣添加量大于28%时，紫花苜蓿的总生物量显著低于对照(P ＜ 0.05)，35%的锰渣添加量下，黑麦草的总生物量也显著低于对照(P ＜0.05)。说明添加适量的锰渣可以促进植物生长，尤其是黑麦草。这是因为电解锰渣中含有大量的氮、磷、钾等营养元素，并含有大量可溶性的矿质元素，这为植物生长提供了一定的养分，并且锰元素本身也是植物正常生命活动中所必需微量矿质元素，适量的锰能够刺激一些酶的活性，促进植物生理代谢及生长[13]，但是锰渣添加量过高会起抑制作用。本研究中黑麦草的光合色素含量随着锰渣添加量的增加均出现不同程度的增加，说明锰渣添加后促进了黑麦草光合色素的合成，而紫花苜蓿的光合色素含量都随着锰渣添加量的增加先上升后下降，这与朱园芳等[14]的研究结果一致，这是因为高量添加锰渣使得土壤中锰过量，导致叶绿素的合成受到抑制，叶绿素含量下降。锰作为植物生长的必需元素，不仅是叶绿体结构的必要组成成分，还参与了植物光合作用中电子传递系统的氧化还原过程及水的光解，对维持叶绿体膜正常的结构有重要的作用[15]，但是当达到一定阈值后，高浓度的锰会抑制镁和铁等元素的吸收及活性，并导致叶绿体中相关酶活性降低、叶绿体结构被破坏，致使叶绿素合成降低[16-18]。

表 3 不同锰渣添加量紫花苜蓿和黑麦草对Mn 的富集、转移情况Table 3 Accumulation and transfer of Mn in Medicago sativa and Lolium perenne with different EMR additions

3.2 土壤添加电解锰渣后黑麦草的耐受性及其对锰的累积能力明显高于紫花苜蓿

MDA 是植物器官在受到外界环境胁迫时细胞膜脂过氧化的产物之一，其含量的高低表示膜脂过氧化程度及植物受损程度[19]，重金属胁迫下，植物体内一系列生化反应会引起活性氧过量，导致植物细胞膜脂过氧化、膜系统受损、生理代谢受阻[18]。抗氧化酶(SOD、CAT、POD)能够清除细胞内的过量活性氧，保护细胞免受氧化胁迫的伤害。本研究中，锰渣添加量为7% 时，紫花苜蓿MDA 含量和POD 活性均显著低于对照(P ＜ 0.05)，当锰渣添加量大于28%时，MDA 含量、POD 活性均显著增加(P ＜ 0.05)。锰渣添加后，黑麦草的SOD、POD、CAT 活性相比对照均出现不同程度降低，说明添加锰渣后没有对黑麦草产生氧化胁迫。徐卫红等[20]的研究中也表明黑麦草对重金属Zn 有很强的抗性和耐性，即使在高浓度下，黑麦草生长也未受到抑制，还有研究证明黑麦草对Cd、Pb 也有很强的耐性[21]。紫花苜蓿MDA 含量以及抗氧化酶活性均随着锰渣添加量的增加呈现出不同程度的增加，这与前人研究结果一致[22-23]。添加锰渣后能够刺激紫花苜蓿的POD 和SOD 活性，有研究表明锰是SOD 的一种辅酶基同时也是许多抗氧化酶的激活剂，因此，高浓度锰使得紫花苜蓿体内的POD 和SOD 活性升高[24-25]，并且明显增加了紫花苜蓿的MDA 含量，这说明高含量锰对紫花苜蓿产生氧化胁迫，进而使得植物生长受到抑制，Smith 等[26]研究也得出，高含量锰会抑制苜蓿的生长，而对黑麦草无影响。由此可知，黑麦草的耐受性大于紫花苜蓿。

此外，本研究中，黑麦草和紫花苜蓿的富集系数均为根系大于地上部分，这与Inostroza-Blancheteau等[27]的研究结果一致，这可能与植物的耐性机制有关，通过减少向地上部分转移，从而降低对器官的损伤。黑麦草根系锰含量和富集系数都大于紫花苜蓿，表明黑麦草的根系富集能力比紫花苜蓿强，这是因为黑麦草具有非常发达的侧根，植物通过根系分泌有机酸活化土壤中的锰，然后形成较为稳定的螯合物，不仅促进了植物对锰的吸收[8,26]，还降低重金属的胁迫。并且禾本科草对锰的吸收能力一般超过苜蓿草。黑麦草属于耐性较强的禾本科草，大部分研究表明，黑麦草对Cd、Cu、Pb、Zn 等重金属也有较强的累积能力[28-31]。生物富集系可用于评估植物吸收和累积重金属的能力，其值越大，富集能力越强。紫花苜蓿的转移系数大于黑麦草，袁敏等[32]研究也得出，紫花苜蓿对Pb、Zn、Cd 也具有较强的转移能力，这可能与紫花苜蓿本身水分含量高、蒸腾量大、新陈代谢旺盛等生长特性有关[33]，随着锰渣添加两种植物的转移系数逐渐减小，对照中两种植物的转移系数均为最大，这可能是因为对照的基质中锰含量较低，植物为了维持正常的代谢活动将大部分的锰运输到茎和叶中。总体来说，黑麦草的耐受性及其对Mn 的富集能力明显高于紫花苜蓿，更适合作为锰渣堆场生态修复的先锋植物。但对于两种植物对锰的富集和转运能力有所差异性还有待于进一步研究。

4 结论

1)电解锰渣的添加会抑制种子萌发，但能促进植物的生长，特别是黑麦草。过高的锰对紫花苜蓿的叶绿素起到抑制作用，但促进了黑麦草的光合色素的合成。添加锰渣后，紫花苜蓿中MDA 含量、抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性出现明显的提高，而黑麦草中MDA 含量和抗氧化酶活性都低于对照，这两种植物对高锰环境都具有一定的耐受性，但黑麦草的耐受性明显大于紫花苜蓿。

2)总体上，黑麦草对锰的累积能力强于紫花苜蓿，但是紫花苜蓿对锰具有较强的转运能力，两种植物都可作为锰渣堆场生态修复的备选植物，但锰渣对紫花苜蓿的抑制作用大于黑麦草，黑麦草更适合作为锰渣堆场生态修复的先锋植物。