早期针刺对颅脑损伤大鼠神经功能和Cleaved Caspases-3的影响*

杜若桑 张晓辉 柳依江 郑淑美 崔 海

（首都医科大学，北京 100069）

颅脑损伤（TBI）是指外力导致的脑部结构或功能上的损伤。在工业化社会中它是青年人的主要死因之一［1］。TBI发生后常因细胞凋亡、炎症反应、血脑屏障破坏、氧化应激、兴奋性毒性等病理改变导致继发性损伤［2-4］。针灸对TBI的疗效已被诸多临床和动物研究证实［5-7］。本研究拟观察针刺对TBI大鼠脑皮质内凋亡相关蛋白Cleaved Caspases-3蛋白表达、脑组织病理形态表现和运动、感觉等神经功能的影响来探讨针刺对TBI的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级6～7周龄雄性SD大鼠40只，体质量200～240 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。于首都医科大学动物实验中心分笼饲养，温度（25±2）℃，于光照、黑暗周期各12 h的恒温恒湿环境，自由摄食和饮水。

1.2 仪器与试剂

精密颅脑损伤撞击器PCI3000（美国Hatteras instruments公司），68025型脑立体定位仪（深圳瑞沃德生命技术有限公司），华佗牌一次性无菌针灸针（0.30 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司），7750型Rotarod大鼠转棒仪（意大利UgoBasile公司），酶标仪（美国Thermo），VE186转移电泳槽（上海天能科技有限公司），Cleaved Caspase-3抗体（美国CST公司，9661T），ECL发光液（美国Millipore公司，WBKLS0500），BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，02912E），蛋白酶抑制剂（瑞士罗氏公司，04693116001），Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（美国Jackson公司，111-035-003），Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（美国Jackson公司，115-035-003）。

1.3 分组及造模

1）动物分组：适应性饲养7 d后根据随机数字表法将大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、针刺组，每组各10只。模型组和针刺组制备TBI模型。假手术组仅开骨窗不进行打击，空白组不进行任何处理。2）模型制备：将10%水合氯醛溶液腹腔注射以麻醉大鼠（0.4 mL/100 g），大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪，在大鼠眼睛后方沿正中线做长约1.5 cm的纵形切口，暴露出前囟。随即在前囟向右旁开2.5 mm，向后1.5 mm处为圆心，用颅钻钻出直径约6 mm的圆形骨窗，保持硬脑膜完整。随后应用PCI3000撞击器（打击参数设置为撞击头直径为4 mm，打击速度为4 m/s，打击深度为 2 mm，停留时间 100 ms）撞击此处造成 TBI［8］，最后清理创口，将骨瓣还纳于骨窗中，用组织胶水封闭，最后缝合头皮。

1.4 干预方法

针刺组大鼠在造模完成后即接受针刺：针刺大鼠水沟、风池（双侧）、内关（双侧）、足三里（双侧），穴位定位依据华兴邦等制定的大鼠穴位图谱［9］。水沟穴向上斜刺1 mm，捻转10 s后出针。风池直刺3 mm，内关直刺1～2 mm，足三里直刺3～5 mm，3穴行平补平泻手法后留针20 min。造模术后即进行针刺治疗，治疗每日1次，共治疗7 d。假手术组、模型组和空白组均给予同样的抓取、固定，每日1次，但不进行任何治疗。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 改良的神经功能评分（mNSS） 分别于治疗第2天、第4天和第7天应用mNSS评分表评估大鼠神经功能：分别从运动、感觉（视觉、触觉、本体觉）、平衡、反射4方面进行评估。总分18分，评分越低代表神经功能损伤程度越轻。1～6分为轻度损伤，7～12分为中度损伤，13～18分为重度损伤［10］。

1.5.2 转棒实验（Rotarod test） 转棒实验可检测大鼠运动协调和平衡能力［11］。造模前3 d进行适应性训练，治疗前1 d、治疗第2天、第4天和第7天进行转棒实验。测试时将大鼠放置在转棒仪上，转棒仪设置为加速模式：5 min内转速由4 r/min匀速增加至40 r/min，启动仪器后大鼠如果从转棒上掉落或抱住转棒旋转2圈均为测试解释，记录大鼠在转棒仪上停留的时间，每只大鼠进行3次实验，取其平均值作为本实验最终数据。数值越低表明大鼠损伤程度越重。结束第7天治疗后完成mNSS评分和Rotarod test，然后将大鼠麻醉取脑，在造模损伤局部的中心、与大鼠身体长轴垂直切分为两部分：一部分置于盛有4%多聚甲醛的EP管中常温固定24 h以备HE染色法检测；另一部分存放于-80℃冰箱待Western blotting检测。

1.5.3 HE染色法观察大鼠脑组织形态表现 在脑组织上切取厚约4 mm左右的标本，进行石蜡包埋，蜡块经切片、脱蜡，苏木素-伊红（HE）染色，脱水，透明和中性树胶封片后成片，光镜下放大200倍观察。

1.5.4 Western blotting法检测损伤脑组织Cleaved Caspase-3蛋白表达 取损伤周围脑组织50 mg，加200 μL RIPA裂解液后，匀浆10 min离心20 min，取上清进行蛋白定量及蛋白样本制备。根据目的蛋白的分子量，配制10%分离胶，浓缩胶浓度为5%。电泳后用电转膜仪将凝胶上的蛋白转至PVDF膜上。转膜完成后用丽春红染色试剂对膜进行染色，将膜完全浸没于5% BSA-TBST中封闭，水平摇床孵育1 h。5% BSA-TBST稀释一抗，4℃水平摇床孵育过夜。次日孵育二抗，TBST洗膜3次每次10 min。将ECL滴加到膜的蛋白面，显影2 min后定影。置于成像仪中采集图像，使用Gel Image ststem ver.4.00（上海天能科技有限公司）分析条带灰度值，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值计算出目的蛋白相对表达量。

1.6 统计学处理

应用SPSS22.0软件进行各项实验数据的统计分析，计量资料以（）表示。符合正态分布且方差齐时，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法；方差不齐则采用Welch法，组间比较采用Dunnett′T3法。数据不满足正态分布的进行非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组mNSS评分比较

见表1。假手术组与空白组大鼠mNSS评分相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。术治疗第2、4、7天时，模型组大鼠评分均显著高于假手术组和空白组（均P＜0.01）。治疗第2天针刺组和模型组无统计学差异（P＞0.05），但治疗第4和7天时，针刺组评分低于模型组（均P＜0.05）。

表1 各组大鼠mNSS评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠mNSS评分比较（分，±s）

注：与假手术组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

组别空白组假手术组模型组针刺组n 10 10 10 10 2 d 0.20±0.42 0.60±0.84 11.00±2.45△△8.10±2.13 4 d 0.10±0.32 0.20±0.42 7.60±2.27△△5.00±1.15*7 d 0 0.1±0.32 5.80±1.87△△3.40±1.17*

2.2 各组Rotarod test评分比较

见表2。假手术组与空白组大鼠转棒实验评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）术前各组无差异（P＞0.05）。治疗第2、4、7天时，模型组大鼠评分均著低于假手术组（P＜0.05或P＜0.01），与模型组相比，针刺组在治疗第4、7天评分明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各组大鼠Rotarod test评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠Rotarod test评分比较（分，±s）

组别空白组假手术组模型组针刺组n 10 10 10 10-1 d 161.40±70.00 155.10±52.46 174.10±38.71 163.30±75.99 2 d 158.00±81.45 152.50±46.72 83.30±20.83△△94.50±37.63 4 d 168.90±76.55 160.50±47.50 91.60±20.49△△149.70±44.61*7 d 177.00±67.84 158.20±50.87 103.30±37.20△179.50±57.41**

2.3 各组大鼠脑组织形态表现

见图1。空白组和假手术组大鼠脑皮质细胞排列均匀，胞核染色为蓝色，可见核仁，胞浆粉红，轮廓清晰。模型组和针刺组有出血和炎性细胞浸润现象，细胞排列紊乱，细胞核固缩、碎裂明显；组织空泡样改变明显，脑组织结构紊乱；坏死周围出现纤维增生和瘢痕组织。针刺组还可观察到正常神经元，组织疏松和紊乱轻于模型组，修复情况好于模型组。

图1 各组大鼠脑组织的病理变化（HE染色，200倍）

2.4 各组大鼠脑皮质内Cleaved Caspases-3蛋白表达水平的比较

见表3。假手术组与空白组大鼠Cleaved Caspases-3蛋白表达相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组大鼠Cleaved Caspases-3蛋白相对表达量显著高于假手术组、空白组（P＜0.01），针刺组表达量低于模型组（P＜0.01）。

表3 各组大鼠脑组织Cleaved Caspases-3相对表达量比较（±s）

表3 各组大鼠脑组织Cleaved Caspases-3相对表达量比较（±s）

组别空白组假手术组模型组针刺组n 10 10 10 10相对表达量0.37±0.18 0.39±0.14 1.31±0.47△△0.84±0.11**

3 讨论

Caspase家族是调控细胞凋亡的关键因素，其促凋亡作用可发生在细胞凋亡的各个时期［12-13］。根据结构和功能的不同，Caspase家族可被分为凋亡的启动者和执行者。Caspase-3属于后一种，它是该家族最重要的蛋白酶，是多种凋亡刺激信号传递的汇集点和凋亡蛋白酶级联反应共同下游的必经通路，总之是凋亡关键的执行者［13-14］。凋亡早期，内源性通路和外源性途径联合将Procaspases-3剪切成具有活性的Cleaved Caspases-3，继而推动凋亡进程，即Cleaved Caspases-3是Caspase-3的活化形式［15-17］。

细胞凋亡是TBI后脑损伤的机制之一，损伤后兴奋性毒性、细胞内钙超载和自由基均可导致细胞凋亡的发生［18-19］。Caspase-3在TBI后细胞凋亡中起到重要作用，此时非活性状态的Procaspase-3被剪切活化，随后导致细胞程序性死亡和脑组织损伤［20］。另有临床研究［21］发现重型TBI患者血清Caspase-3水平明显高于对照组，死亡组血清Caspase-3水平明显高于存活组；因Caspase-3与TBI严重程度密切相关，由此Caspase-3水平可作为患者预后的判断因素之一。研究发现TBI伤后4 h Cleaved Caspases-3主要表达在和胼胝体相邻的大脑皮质中，但伤后24 h就广泛分布于受伤皮质的整个区域内［22］。YANG等［23］观察了伤后72 h内的Cleaved Caspase-3的变化：伤后6 h表达增高，12 h时达到峰值，随后开始下降。杜勇等发现相对于假手术组，TBI模型组24 h时Cleaved Caspases-3在脑内表达上升，伴随着Bcl-2（Bcl-2是抑制细胞凋亡的调节因子）蛋白相对表达量的显著降低、脑水肿和神经功能损伤的表现［24］。

针灸治疗TBI具有多途径多靶点的特征，起效机制多样，抑制细胞凋亡即是针灸起效机制之一［25］。如针刺可调节凋亡调节因子P53、Bax和Bcl-2的表达：张毅敏等［26-27］研究发现针刺水沟、百会等穴可使TBI大鼠脑组织中P53和Bax表达降低，Bcl-2升高，最终减少细胞凋亡，因P53和Bax能加速凋亡，而Bcl-2后者可抑制凋亡。另有研究发现电针可降低TBI大鼠海马CA1区中Caspase-3的表达，并伴随着认知功能的改善［28］。

根据中医理论，TBI病因病机是头部受到外力撞击，血溢脉外，气滞血瘀，神志昏蒙，经络瘀阻。本研究选用了水沟、风池、内关、足三里治疗TBI。据文献统计此4穴均是临床上针灸治疗TBI的高频用穴［29］。其中水沟和风池位于头面颈部，而TBI病位在头脑，二穴靠近病变所在：水沟属督脉，督脉“入属于脑”，针刺水沟可开窍、醒神、苏厥；风池可醒脑开窍，疏调头部气机。内关和足三里位于四肢，可疏通肢体经络，治疗TBI所致肢体功能障碍。另外内关属心包经，心主神志、神志，可调理心气、宁心安神，促进气血运行。足三里属足阳明胃经，脾胃为后天之本，气血生化之源，本穴可补益气血，强身健体。

因WB技术是检测蛋白表达特定且灵敏的方法，本研究利用此技术检测了脑皮质内Cleaved Caspases-3蛋白表达水平，结果再一次证实了TBI后大鼠脑组织内Cleaved Caspases-3的表达增多，并伴有神经功能损伤和脑组织结构损伤的表现。神经功能损伤是利用mNSS评分和Rotarod test评分来评估，因前者可从运动、感觉、平衡、反射4方面对大鼠神经功能做出综合全面评估［10］，而后者能进一步更客观地评估大鼠运动协调和平衡能力［11］。脑组织结构损伤是通过HE染色观察得来，因HE染色技术是目前组织学、病理学等最常用的技术方法之一，它以不同颜色显示细胞质和细胞核，可以直观地显示出脑组织形态结构，通过它可观察到组织形态结构的改变。而经过针刺治疗后，大鼠脑皮质中Cleaved Caspases-3表达有明显下降，脑组织形态学损伤减轻；并在针刺治疗后第4天和第7天mNSS评分和Rotarod test评分优模型组，这意味着大鼠活动、感觉等行为学表现改善明显。本研究说明针刺可以通过抑制Cleaved Caspases-3的表达，减轻细胞凋亡达到修复脑组织和保护神经功能的疗效。而针刺通过何种信号通路或路径抑制Caspases-3则需要进一步的研究。