桃红四物汤组方有效单体成分对早期骨折治疗的量效关系研究*

余晓愉 熊 辉△ 周钰健 杨 卓 周文佳 陆小龙

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.深圳宝安纯中医治疗医院，广东 深圳 518000；3.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

在中医学发展史进程中，度量标准经历了多次变化，这种变化使得中医方药的用量不能形成一个系统完整的理论体系，阻碍了中医药的现代化发展［1］。量效关系是指在一定范围内，药物的作用效应随着剂量（或浓度）的变化而改变［2］，历代医家都在不停探索中药的最佳量效关系，他们根据自己的临床经验以及对中药量效关系的认识，提出了各种不同的见解。有学者认为以中医基础理论及方剂组方理论为基础，阐明中药的量－效关联规律［3］。仝小林教授［4］曾经提出以实验结合文献研究并以临床疗效评价为中心的中药量效关系研究模式。但无论是哪种研究方式，仍处于总结前人经验应用于实践的阶段，成熟、科学的理论依据不能够在临床实践中合理运用，中医药临床疗效的提高受到制约。桃红四物汤最早见于清代吴谦的《医宗金鉴》，主要功用为活血化瘀，是治疗骨折的常用方。课题组前期实验研究表明，桃红四物汤组方药物主要水溶性有效单体成分组方与原方水煎剂均可促进大鼠早期骨折愈合，缩短骨折愈合时间，治疗早期骨折作用无明显差异［5］，而桃红四物汤原方存在量效关系，疗效与剂量为正相关性［6］。本研究拟从不同剂量桃红四物汤单体成分组方对大鼠早期骨折愈合的影响，探讨其量效关系，为该方的进一步应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级12周龄雄性SD大鼠90只，体质量200～220 g，购自湖南斯莱克京达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。动物质量合格证号：1107271911004705。湖南中医药大学SPF级中心实验室喂养，室温22～26℃，相对湿度35%～70%。

1.2 实验药物 桃红四物汤单体成分：苦杏仁苷，批号20190401，货号A0093；羟基红花黄色素A，批号20190508，货号A0380；梓醇，批号20190102，货号A0215；毛蕊花糖苷，批号20190301，货号A0943；阿魏酸，批号20190303，货号 A0050；芍药苷，批号 20190202，货号A1298；川芎嗪，批号20190301，货号A1088。单体成分均由成都曼斯特生物科技有限公司提供，按照药典有效成分含量溶于水配成相应浓度给药。

1.3 试剂与仪器 水合氯醛，批号20XS09R25，货号30037517，上海浦山化工有限公司；4%乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙液，批号D20092506，货号AR1071，博士德生物公司；4%多聚甲醛，批号D20061401，货号AR1068，博士德生物公司；鼠VEGF试剂盒，批号20190509，货号69-35236，上海森雄科技实业有限公司；80万单位青霉素，批号2003104，货号15140-122，华北制药股份有限公司。ER－182 A型电子天平，日本AND公司；无菌操作台，苏州市苏杭科技器材有限公司；显微镜，日本Motic；RM2235石蜡切片机，德国LABSTAR；KDBM电脑生物组织包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；RE-2000B旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；电动玻璃匀浆器，新芝有限公司。MoticBA600-4显微摄像图像分析系统，麦克奥迪实业公司；Image-Pro Plus图像分析软件，美国Image-Pro公司。

1.4 分组与造模 将90只大鼠按随机数字表法分为空白组（正常对照）15只、模型制备组75只。造模方法［7］：使用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉，待麻醉产生效应后，将麻醉后的大鼠采用俯卧位的方式将其固定在无菌操作台上，将大鼠左侧大腿股外侧充分暴露出来，清除大鼠的毛发后，然后进行常规消毒；消毒后，用手术刀在大鼠左股外侧作一3 cm左右纵向切口，向下逐层剥离各组织结构，大鼠股外侧肌进行钝性分离，上下推移股骨干使其充分显露出来；使用骨锯截断股骨干中段，切下端骨皮质时用止血钳折断股骨干，使断端保持其完整性；将一根直径为1 mm的克氏针于断端逆行插入股骨干近端，再从股骨大转子同一侧方向穿出；当骨折断端复位后，沿克氏针方向顺行穿回；术肢轻微活动，当复位完成后，剪除多余部分，缝合切口，造模完成。假手术组将对SD清洁级雄性大鼠只切开缝合不造模。进行手术后，若观察到股骨中段横形骨折可认为是骨折模型，发现大鼠粉碎性骨折则剔除，造模至所需样本量，待大鼠恢复正常体温后予以青霉素80万单位腹腔注射，每日1次，预防感染，连续给药3 d。将造模后的75只大鼠随机分为假手术组、模型组及单体成分组方低、中、高剂量组，每组15只。

1.5 给药方法 按照60 kg成人与动物体表面积换算公式［8］计算，大鼠每日给药剂量为9 g/kg，即给予200 g体质量大鼠每日1.8 g的剂量，设定量效比值（R为1∶3）分为3个梯度，分别为1∶3∶9，中剂量组作为成人等效剂量组，则3、9、27 g/kg对应低、中、高剂量组。空白组、假手术组、模型组分别予以等体积生理盐水灌胃。造模成功24 h内开始第1次给药，每日给药时间相同，每日2次，灌胃间隔时间为8 h，连续灌胃14 d。

1.6 标本采集与检测 1）大鼠给药3、7、14 d后分组取材，每组每次随机选择5只大鼠，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉后经腹主动脉采血，取出左侧股骨置于4%多聚甲醛溶液中固定，固定处理后再浸泡于4%乙二胺四乙酸（EDTA）中脱钙。2）造模前、造模后3、7、14 d 4个时相点，取大鼠左侧股骨中段同一部位，剃毛后然后用红线包围并标记，用不锈钢带表卡尺测量做了标记的红线3次，取平均值。3）骨折早期断端病理形态变化。标本浸蜡3.5 h，石蜡包埋，切片，0.01 mol/L PBS缓冲液中冲洗，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，苏木素-伊红（HE）染色，封片，显微镜下观察。4）血清血管内皮生长因子（VEGF）浓度检测。造模后3、7、14 d使用酶联免疫吸附测定（ELISA）测血清VEGF的浓度，每组每次5只，取平均值。5）骨体积（BV）和骨性骨痂体积（TV）百分比（BV/TV%）检测。通过Micro-CT进行扫描，将造模后3、7、14 d大鼠股骨中段骨折位置和骨折处周围的骨进行三维重建分析，可测得BV和BV/TV百分比。

1.7 统计学处理 应用SPSS25.0统计软件。计量资料以（±s）表示。满足正态分布者，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者用LSD法检验，方差不齐者用Dunnet′s T3法检验；不符合正态分布者用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况 造模前，各组大鼠活动自如，精神良好，饮食、二便正常。造模后，除空白组对照组外，其余各组大鼠在恢复体温后均有活动受限，精神状态欠佳，饮食减少变化。单体成分组方各剂量组与模型组大鼠在术后则出现造模部位红肿，局部肤温升高，跛行等症状。灌胃开始后，模型组大鼠精神状态、饮食、活动未见明显变化；单体成分组方低、中剂量组大鼠同给药前相比，其一般情况均有不同程度的好转；高剂量组大鼠精神与其余组相比精神状态较亢奋，纳食量及活动、反应力均有增加，表明在使用单体成分组方药物灌胃能在一定程度上改善大鼠早期骨折的临床症状。

2.2 各组大鼠肢体肿胀程度比较 见表1。在造模后2 h及3、7、14 d，测量大鼠肢体肿胀程度，在灌胃后3 d左右为测定肢体肿胀程度区间的峰值，随后则呈现下降趋势；与空白组比较，假手术组在3、7、14 d 3个时相点大鼠肢体肿胀程度不明显（P＞0.05）；与假手术组比较，模型组大鼠在3、7、14 d 3个时相点大鼠肢体肿胀程度明显（P＜0.01）；与模型组比较，各剂量组大鼠在3、7、14 d 3个时相点肢体肿胀程度均有减轻，其中以高剂量减轻最为明显（P＜0.05或P＜0.01）。提示单体成分组方具有消除大鼠早期骨折肢体肿胀的作用，量效呈正相关，高剂量组效果最好。

表1 各组大鼠肢体肿胀程度比较（cm，±s）

表1 各组大鼠肢体肿胀程度比较（cm，±s）

注：与空白组比较，☆P＜0.01，☆☆P ＜0.05；与假手术组比较，*P＜0.01，**P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.01，△△P＜0.05；与低剂量组比较，★P＜0.01，★★P＜0.05。下同。

组别空白组假手术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n 5 5 5 5 5 5造模后2 h 4.043±0.102 4.150±0.203 4.934±0.135*4.896±0.129 4.616±0.071△△★★4.581±0.024△△★灌胃3 d 4.073±0.112 4.142±0.209 5.729±0.279*5.443±0.181△△5.0715±0.106△△★★4.871±0.100△★灌胃7 d 4.704±0.100 4.143±0.210 5.464±0.155*5.273±0.094△△4.972±0.132△△★★4.510±0.186△★灌胃14 d 4.170±0.113 4.145±0.149 5.349±0.104*5.043±0.110△△4.616±0.124△△★★4.171±0.140△★

2.3 各组大鼠血清VEGF含量比较 见表2。与空白组比较，假手术组在3、7、14 d 3个时相点大鼠血清VEGF浓度表达均有所增加（P＜0.05）；与假手术组比较，模型组在3、7、14 d 3个时相点大鼠血清VEGF浓度表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各剂量组在3、7、14 d 3个时相点大鼠血清VEGF浓度表达均有明显增加，其中以高剂量增加最为明显（P＜0.05或P＜0.01）。说明单体成分组方能够促进血清中VEGF的表达，从而加速早期骨折的愈合，量效呈正相关。

表2 各组大鼠血清VEGF含量比较（ng/L，±s）

表2 各组大鼠血清VEGF含量比较（ng/L，±s）

组别空白组假手术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n 5 5 5 5 5 5灌胃3 d 106.240±6.651 111.290±6.820☆☆125.320±5.010*137.780±5.900**149.01±9.492**△★★163.010±7.391*△★灌胃7 d 110.062±9.114 115.101±8.294☆☆138.502±5.704*149.404±4.705**159.984±9.424**△★★180.104±5.805*△★灌胃14 d 107.332±6.445 108.550±7.219☆☆152.292±6.249*164.245±7.020**175.540±8.229**△★★202.016±8.940*△★

2.4 各组大鼠骨体积（BV）值、大鼠骨体积分数（BV/TV）值比较 见表3，图1。与模型组比较，单体成分组方各剂量组在3、7、14 d 3个时相点大鼠BV值、BV/TV值均有所增加，其中均以高剂量组增加最为明显（P＜0.05或P＜0.01），低、中剂量组间差异不明显。

表3 各组大鼠BV值、BV/TV比值比较（±s）

表3 各组大鼠BV值、BV/TV比值比较（±s）

组别模型组（n=5）低剂量组（n=5）中剂量组（n=5）高剂量组（n=5）时间灌胃3 d灌胃7 d灌胃14 d灌胃3 d灌胃7 d灌胃14 d灌胃3 d灌胃7 d灌胃14 d灌胃3 d灌胃7 d灌胃14 d BV值37.397±2.270 42.159±3.129 51.259±4.029 44.340±3.279△△54.316±2.850△△64.392±2.900△△46.259±4.640△△55.501±2.995△△68.620±3.690△△51.407±3.104△★★62.605±3.702△★★74.625±4.159△★★BV/TV比值0.020±0.534 0.200±0.051 0.172±0.0 52 0.238±0.764△△0.345±0.017△△0.443±0.076△△0.273±0.447△△0.447±0.014△△0.501±0.015△△0.376±0.053△★★0.741±0.046△★★0.841±0.448△★★

图1 术后大鼠股骨显微Micro-CT图像

2.5 各组大鼠组织病理学分析结果 病理切片结果显示：空白组和假手术组大鼠骨皮质连续，与骨小梁互相连接形成海绵状向骨髓腔延伸，骨小梁间充于骨髓（见图2 A、B）；灌胃3 d后，可见模型组骨折断端骨皮质不连续，局部骨组织坏死（见图2 C1）；3个给药组血肿机化，出现少量的软骨、成骨、破骨细胞及肉芽组织，骨折断端开始连接（见图2 D1、E1、F1）；灌胃7 d，模型组骨折断端开始初步连接，可见少量软骨细胞及肉芽组织形成（见图2 C2）；各剂量组则可见到不同程度软骨细胞骨化、钙化，骨痂及骨髓腔形成，其中高剂量组已出现少量骨小梁（见图2 D2、E2、F2）；灌胃14 d，模型组软骨细胞进一步增多，已可见少量纤维骨痂和软骨痂，少量骨小梁，无环状骨痂及骨髓腔形成；3个给药组大量软骨痂钙化，可见新生骨髓腔，平行于股骨纵轴、排列规则且致密的新生骨小梁数量逐渐增加，以高剂量组最为显著（见图2 D3、E3、F3）。

图2 术后大鼠股骨切片（HE染色，40倍）

3 讨论

骨折愈合是一个复杂的过程，其最基本的过程为骨折部位募集祖细胞形成初始软骨痂，经过血管再吸收、骨形成和骨化后骨折愈合［9］。骨折断端血管生成是促进骨折愈合的重要因素，而骨折断端血运被阻断，血管生成速度缓慢且不连续，这是临床治疗骨折最需要攻克的两大难题［10］。VEGF能够促进骨折断端血液循环中内皮细胞分化增长，并提供氧气、养料，从而加速血管生成速度，骨折断端血运得以重建，初步连接骨折断端［11］。VEGF还能通过协调各类骨细胞，激发其运动分化功能，从而促进创伤性骨折的修复与愈合［12-14］。VEGF的表达和生成受多种细胞影响，原始骨细胞及成骨细胞受到刺激后会分泌促血管生成因子，其中就包括VEGF，其中成骨细胞是VEGF的主要来源之一［15］。课题组前期研究表明单体成分组方能够显著提高VEGF的表达，促进骨折断端血管新生，同时促进骨折愈合，缩短骨折愈合时间［5］。

中医认识疾病和治病的基本原则是辨证论治，在临床实践中，同一中药复方可用于治疗不同疾病的类似证型，虽然中药复方基本相同，但对于不同疾病，中药的使用剂量往往不同，所有对于中药复方来说，其“治疗窗”较宽，而“剂量阈”相对较低。近年来中药复方量效关系的研究思路越来越多，但并没有形成一个完整的理论体系，有基于数据挖掘的方式，以人为本体，对各类古籍及现代名老中医医案中的方剂药物剂量进行系统整理，从中得出量效规律［16-17］。也有针对效应物质的研究，学者通过药效物质基础层面，运用中药血清药理学、代谢组学等研究方式来剖析中药复方量效关系［18］。亦有将临床疗效评价为出发点中心，将医案、实验及文献多重结合的方式，归纳总结剂量的合理范围，正确认识“量”和“效”的相对关系［19］。目前，关于中药复方量效的关系研究仍处于摸索阶段，建立和健全具有中医药特色的量效关系研究方法及体系，用科学正确的方法诠释中药复方量效关系，是中医药现代化进程中必须解决的重大问题。

本实验研究结果显示，通过观察大鼠一般情况、测量肢体肿胀度、测定血清VEGF浓度、运用显微CT和光学显微镜技术，明确了桃红四物汤单体成分组方可以通过调控VEGF表达水平达到加速早期骨折愈合的作用，且存在量效关系，其疗效与剂量、时相点呈正相关性，其中以桃红四物汤单体成分组方高剂量组疗效最佳。这与上文论述的实验结果及文献报道基本一致。本研究为桃红四物汤单体成分组方加速早期骨折愈合更深入的机制研究提供了实验基础，为后期的临床应用提供了更多依据。