升陷汤治疗低血压性脑梗死的网络药理学作用机制研究*

寿昕洋 张弈舒 陈 冰 陈思邈 陈伟燕 裘 涛 张宇燕

（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

缺血性脑卒中具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点［1-2］。低血压性脑梗死在缺血性脑卒中危险因素中占有重要地位［3］。升陷汤由黄芪、柴胡、升麻、知母和桔梗组成，始载于张锡纯的《医学衷中参西录》，治“大气下陷”所致诸症。目前升陷汤临床用于心脑血管疾病的治疗，对低血压［4］、慢性心力衰竭［5］、分水岭脑梗死［6］、脑卒中后眩晕［7］均有较好的临床疗效。升陷汤对低血压性脑梗死的研究，大多数集中于临床应用及对组方中药及成分的研究。本文利用网络药理学从多成分、多靶点与多通路的角度阐释药物、靶点、疾病间相互作用的整体性，为多成分的中药作用机制研究提供方法［8］的优势，开展中药复方升陷汤组分、成分、作用靶点与低血压性脑梗死的病理机制的相互关系分析，探讨升陷汤治疗低血压性脑梗死及改善预后的作用机制。

1 方 法

1.1 升陷汤组分药物的活性成分、药物靶点筛选 运用TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）筛选升陷汤活性成分、药物靶点。

1.2 低血压性脑梗死相关基因筛选 在OMIM、GEN-ECARD、DRUGBANK等数据库中，以“Hypotensive cerebral infarction”为关键词，检索与低血压性脑梗死相关的基因。

1.3 活性成分-交集基因筛选 将1.1和1.2中筛选到的靶点分别上传至韦恩图，得到药物靶点与低血压性脑梗死相关基因的交集，称交集基因。

1.4 交集基因名称规范化 借助UniProt数据库查询“1.3”所得交集基因的基因名与ID，限定物种为人。

1.5 PPI网络和药物-有效成分-交集基因网络图构建 将“1.4”中得到的交集基因输入STRING，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为最高，并进行模块化分析。将得到的TSV文件和药物活性成分，导入Cytoscape 3.7.2软件，以≥10的度值为筛选条件获得PPI网络，以≥5的度值、≥1倍接近中心性的中位数及≥1倍介数中心度中位数获得药物-有效成分-交集基因网络图。

1.6 交集基因的模块化通路分析 将1.4得到的模块基因分别导入DAVID进行GO富集分析和KEGG通路分析，限定EASY为0.05，各取P值排名前十的条目。

2 结 果

2.1 升陷汤有效成分筛选 以“黄芪”“柴胡”“升麻”“知母”“桔梗”为关键词，以OB≥30%、DL≥0.18为条件，删除无靶点对应的化合物，合并共有化合物，筛选出活性化合物69个。

2.2 交集基因筛选和药物分类 并通过OMIM、GENECARD、DRUGBANK数据库和制作韦恩图，筛选得到低血压性脑梗死相关基因1 328个，药物靶点197个，交集基因131个。

2.3 交集基因PPI网络构建 通过STRING中的聚类分析（K-means算法），交集基因被分为3大模块，结果显示模块一内86个，模块二内25个，模块三内20个。将生成的TSV文件导入Cytoscape 3.7.2软件分析，包含118个节点，538条边，平均节点度值为9.11（见图1），根据Degree值大小筛选出前10位的靶点（见表1）。

图1 交集基因PPI网络图

表1 度值排名前10的交集基因及其部分拓扑参数

2.4 药物-有效成分-交集基因网络图构建 将升陷汤有效成分和交集基因导入Cytoscape3.7.2软件，建立药物-有效成分-交集基因网络图。该网络共包括176个节点（40个化合物节点、131个靶点节点、5个药物节点）。该网络中每个化合物平均与10.50个靶点相互作用，每个靶点平均与3.20个化合物相互作用；从化合物的角度，有22.5%的化合物的作用靶点≥15个，其中靶点≥30个的化合物3个，经分析度值排名前5位的化合物分别是槲皮素、木樨草素、山柰酚、7-O-甲基异丙炔醇和脱水淫羊藿素，分别能与93、42、33、23、19个靶点蛋白发生相互作用；从靶基因的角度，度值排名前5位的是PTGS2、PTGS1、AR、ADRB2、RXRA，分别能与31、23、14、13、12个化合物发生相互作用（见图2）。

图2 药物-有效成分-交集基因网络图（度值≥5）

2.5 GO富集分析 PPI聚类分析后，交集基因分为3大模块，结果显示模块一内86个，模块二内25个，模块三内20个。将3个不同模块内的靶点分别进行GO分析，各取P值排名前10的条目（见图3）。GO分析结果表明，升陷汤治疗低血压性脑梗死是多种生物学过程共同参与的，体现了升陷汤多靶点、多层次的作用特点。

图3 各模块靶点GO分析结果前10名

2.6 KEGG通路分析 KEGG通路富集得出靶点主要富集在癌症相关（癌症途径、前列腺癌、膀胱癌、小细胞肺癌、结肠直肠癌、慢性骨髓性白血病、肿瘤坏死因子信号通路、癌症蛋白多糖）、信号通路相关（cGMP-PKG信号通路、钙信号通路、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路、toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、甲状腺激素信号通路、类节点受体信号通路）、传染病相关（利什曼病、疟疾、乙型肝炎、非洲锥虫病、百日咳、南美锥虫病、军团菌病）、神经活性配体受体相互作用、肌动蛋白骨架的调节（见图4）。KEGG结果显示，升陷汤通过多种疾病通路、信号通路改善低血压性脑梗死预后。

图4 各模块靶点KEGG分析结果前10名

3 讨 论

病理性低血压可以导致脑灌注不足发生缺血性脑卒中，此类脑卒中为低血压性脑梗死。中医学无低血压病名，一般辨病属于虚劳，辨证属于大气虚损证，治以扶正补虚、益气升陷法［3］。缺血性脑卒中的中医病名往往被认为是“中风”“厥证”“类中风”等，辨证通常分为中经络和中脏腑，病邪以风、痰、瘀为主，多治以息风、豁痰、化瘀法［9］。升陷汤治大气下陷所致诸症，“大气”早在《黄帝内经》［10］中就被提及，后世医家认为大气即宗气多出于此。张锡纯在《医学衷中参西录》中对大气的作用论述颇详，张氏认为“至胸中大气，独名为大气者，诚以其能撑持全身，为诸气之纲领，包举肺外，司呼吸之枢机，故郑而重之曰大气”［11］。升陷汤方中重用黄芪，其味甘，性微温，兼具补气、益气之功；知母其性凉润，不仅制黄芪之温热，且可清气陷之郁热，再辅以柴胡、升麻与桔梗，以助其升提之效。柴胡、升麻为引经药，分别入少阳、阳明经，以引下陷之大气自左、右而升；桔梗味辛且微温，可引药入肺经，导药力直达胸中。气虚甚者，加人参以培补元气，顾护大气之根，或加净山茱萸肉以收敛大气，防其耗散太过；下陷甚者，倍用升麻，以增全方升提之力［12］。同时张氏又在升陷汤一方后，附有回阳升陷汤、解郁升陷汤以及醒脾升陷汤三个变方，来治疗大气下陷兼加心肺阳虚、气分郁结或脾虚诸证。临床研究也表明升陷汤对低血压性脑梗死治疗及预后有较好的作用。

现代药理研究表明，升陷汤中黄芪具有双向调节血压的作用，其升压作用与增加心排血量和收缩血管有关［13］，黄芪总黄酮对脑缺血再灌注损伤大鼠具有明显的保护作用，其可能与抑制氧化应激水平、减少炎症反应、抗凋亡作用有关［14］；知母中皂苷类成分能增加脑血流量，减轻能量代谢障碍，抗氧化损伤［15］；柴胡皂苷A对脑损伤大鼠认知功能有明显改善作用［16］；升麻苷H-1不仅能透过血脑屏障，同时可调节脑缺血兴奋性氨基酸神经递质的功能紊乱，对缺血脑组织神经元有一定的保护作用［17］。

对单味药、药对、拆方的化学成分及其药理作用的研究表明，升陷汤整方及组分、成分具有较好的治疗脑梗死的作用，本研究在此基础上，利用网络药理学的技术方法，通过“升陷汤活性成分-交集基因-通路”关系网络的搭建、拓扑参数的分析及生物通路的信息挖掘，对升陷汤的活性成分、关键靶点及其分子机制进行关联分析，结果发现升陷汤活性化合物69个，交集基因131个，其中相关度最高的是槲皮素和木樨草素。而槲皮素和木樨草素均能通过调节ROS的生成，抑制IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的表达，发挥其抗氧化及清除自由基、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降糖及免疫调节作用，减轻脑缺血再灌注后神经功能损伤［18］。

PPI网络拓扑学分析结果显示，升陷汤主要通过JUN、MAPK1、TP53、TNF、Akt1、RELA、MAPK14、IL6、APP、CXCL8等靶蛋白改善低血压性脑梗死预后、减轻脑缺血再灌注后神经功能损伤。JUN编码的蛋白是cjun，c-jun既可通过促进双皮质素（DCX）的表达来保护神经元，同时也可激活Caspase蛋白家族以启动细胞凋亡程序［19］。Akt1通过刺激血管内皮生长因子、PI3K-Akt途径诱导血管内皮细胞迁移［20］，从而介导血管生成，改善脑缺血。升陷汤中活性化合物多为黄酮类化合物，可通过抑制炎症转录因子NF-κB实现镇痛、抗氧化、抗炎的作用，减少TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子的产生，增强抗凋亡信号传导，促进髓鞘再生，使神经细胞内部钙超载减弱［21］。APP是结合铜的淀粉样蛋白前体蛋白，与维持铜稳态关系密切，可以被铜离子和生长因子样结构域（GFLD）刺激，加速突触生成，改善神经功能［22］。

PPI聚类分析后，交集基因分为3大模块。各模块GO富集分析结果表明，模块一靶点主要参与对药物反应、细胞对脂多糖的反应、对脂多糖的反应、衰老、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、炎症反应等生物学过程。模块二靶点主要参与对凋亡过程负调控、细胞对缺氧的反应、缺乏配体时的体外凋亡信号通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物学过程。模块三靶点主要参与G蛋白偶联受体信号通路、磷脂酶C激活G蛋白偶联受体信号通路、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、MAPK级联的正调控、细胞增殖的正调控、血小板脱粒等生物学过程改善低血压性脑梗死预后。

KEGG通路富集结果显示，升陷汤通过cGMPPKG信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、cAMP信号通路、甲状腺激素信号通路、钙信号通路改善低血压性脑梗死预后。cGMP-PKG信号通路活化，可调节神经发生［23］，促进神经干细胞的增殖和分化［24］，有效促进脑缺血后海马神经发生，改善认知功能［25］。PI3K-Akt信号通路可以通过活化Akt来刺激NF-κB信号通路、p53信号通路、甲状腺激素信号通路，同时抑制正常细胞凋亡程序和调节血管生成［26-28］。Toll样受体信号通路和NF-κB信号通路在局部脑缺血再灌注模型大鼠脑组织中高表达［29］，黄芪甲苷可通过TLR4/NF-κB信号通路改善血管内皮功能障碍［30］，柴胡多糖通过影响并抑制TLR4信号通路而发挥其抗炎免疫作用［31］。柴胡皂苷A通过cAMP/CREB信号通路对脑损伤大鼠认知功能有较好的改善作用［32］。钙超载已被公认为是脑缺血缺氧性损伤及神经细胞死亡的共同通路，有研究显示钙信号作用与脑缺血再灌注损伤密切相关，调节透血脑屏障能力不佳的活性组分具有进行结构修饰提高临床疗效的价值［33］。

本研究结果表明，具有益气升提作用的升陷汤，其主要活性成分槲皮素、木樨草素等可能通过作用Akt1、TNF、RELA、IL-6、JUN、VEGFA、MYC、MAPK8、CXCL2、ESR1等关键靶点调节多条信号通路，发挥对低血压性脑梗死的治疗作用。升陷汤治疗低血压性脑梗死及改善预后的机制主要集中调节PI3K-Akt信号通路抗凋亡、cGMP-PKG通路促进神经干细胞增殖和分化等过程中。研究结果为进一步探索低血压性脑梗死动物模型、确定治疗时间窗提供了实验依据，也有助于指导临床用药，寻找有效组分和成分、开发新剂型，为开发治疗缺血性脑卒中的中药新药奠定基础。