复发性外阴阴道假丝酵母菌病药物敏感性与耐药基因表达的相关性分析*

李赛男，祁文瑾，黄 蓉，何 霞

(昆明医科大学第一附属医院产科,昆明 650032)

复发性外阴阴道假丝酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis,RVVC)是在1年内VVC症状发作4次或以上的外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)[1]，是常见的妇产科感染性疾病，约占微生物所致阴道炎的25.0%～30.0%。RVVC治疗困难，症状易反复，且由于抗生素的不合理使用增多，导致RVVC菌株产生耐药性可能。近年来，RVVC的发病率逐年升高，且主要致病菌种仍为白假丝酵母菌，而非白假丝酵母菌的致病性亦增高[2-3]。在白假丝酵母菌外排泵系统中，ABC转运蛋白的高表达是其耐药机制产生的重要原因，其中研究较多的外排泵基因是MDR1、CDR1和CDR2。CDR1是白假丝酵母菌最早发现的外排泵基因，CDR1基因过表达被认为与其耐药有着密切关系[4]。本研究拟对RVVC、VVC患者的阴道致病白假丝酵母菌对6种临床常用抗真菌药物的体外药物敏感性实验，进行药物外排泵相关蛋白-多药耐药基因MDR1、三磷酸腺苷结合转运蛋白家族CDR1、CDR2和PDR1基因表达的检测。探讨RVVC、VVC患者阴道致病白假丝酵母菌的药物敏感性差异对于耐药相关基因的表达水平之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 所有菌株均来自昆明医科大学第一附属医院妇产科门诊。患者有明显外阴瘙痒、白带增多、红斑、豆腐渣样或凝乳状白带症状，且镜检可见假丝酵母菌芽生孢子或假菌丝为镜检阳性。经分离、以VITEK 2系统鉴定菌种为白假丝酵母菌菌株213株，其中VVC 137株，RVVC 76株。患者均排除免疫相关疾病、糖尿病或使用免疫抑制剂，无长期使用抗生素病史。

1.2 方法

1.2.1 药物敏感性实验 使用FUNGUS-7药敏试剂盒对两性霉素B、制霉菌素、咪康唑、益康唑、伊曲康唑、氟康唑这6种药进行药物敏感性检测。(1)从培养基上挑取所分离的单个菌落的酵母菌，加入eppendorf管，加生理盐水调成相当于2号麦氏管的浊度；(2)用加液枪吸取100μl细菌培养液加至Neg孔中，作为敏感(不生长)对照；(3)用加液枪吸取100μl用生理盐水调制好的菌液，加入培养液中，充分混匀；(4)每孔加100μl(Neg孔除外)，35℃孵育18～24h；(5)取出条板，每孔加显色液1滴，10min后肉眼判读结果。

1.2.2 耐药基因的表达 (1)RNA提取:将37℃过夜培养的相同量白假丝酵母菌菌落溶于1mol/L山梨醇、0.1mol/L MEDTA的液体中，使溶液OD600在0.6～1.0，置1.5ml eppendorf管中，加0.1%β-巯基乙醇和50个单位溶壁酶，25℃处理24h。破壁后清亮溶液置4℃，5000r/min离心5min，弃上清得到白色细胞团。使用Ultrapure RNA Kit(中国康为世纪公司)按说明书提取假丝酵母菌总RNA。(2)RNA逆转录:使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(北京Transgen公司)进行cDNA合成。反应体系为20μL，包含7μL RNA，1μL Anchored Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μL)，10μL 2×TS Reaction Mix,1μL TranScript RT/RI Enzyme Mix,1μL gDNA Remover。42℃孵育30min。得到的cDNA置-20℃冰箱保存。(3)参考GenBank设计CDR1、CDR2、MDR1、PDR1引物，MDR1和内参基因的引物18SrRNA为内参基因引物序列，见表1。(4)PCR反应体系为15μL，包括2×UltraSYBR Mixture 7.5μL，RNase-Free Water 4.3μL，Template DNA 2μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，设置参数为95℃预变性10min，95℃ 40个循环15s，60℃退火1min。以每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数(Cycle threshold，Ct值)来定量计算基因表达的效果。

表1 引物基因序列

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件包，对于耐药基因表达结果进行卡方检验；对于耐药基因表达量比较，把Ct值转化为2-Ct后取管家基因18SrRNA与目标基因表达的差值，以方差分析或t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 药敏结果 对137株VVC白假丝酵母菌菌株和76株RVVC菌株进行两性霉素B、制霉菌素、咪康唑、益康唑、伊曲康唑、氟康唑药敏试验，见表2。

2.2 耐药基因表达结果 所有实验菌株均有CDR1、CDR2和MDR1基因产物的表达，但PDR1仅在部分菌株中表达。76株RVVC致病白假丝酵母菌中，表达PDR1基因的菌株有15株，其余61株无表达，表达率为19.74%；137株VVC致病白假丝酵母菌中，表达PDR1基因的菌株有41株，其余96株无表达，表达率为29.93%。RVVC组的PDR1基因表达率明显低于VVC组(P<0.05)。

76株RVVC致病白假丝酵母菌中，两性霉素B仅检出一株中敏菌株，未检出耐药菌株，且敏感组只有一株菌株表达PDR1基因，制霉菌素未检出中敏、耐药菌株组的，无法进行统计学分析，故只分析其余5种药物敏感、中敏、耐药菌株组的CDR1、CDR2、PDR1和MDR1基因表达量的情况；5种药物中，两性霉素B、益康唑的耐药菌株仅为1～3株，与中敏菌株合并进行统计分析。结果显示:益康唑的RVVC-I+R组菌株CDR1、CDR2和MDR1基因表达量与RVVC-S组差异无统计学意义(P>0.05)；伊曲康唑、氟康唑的RVVC-R组MDR1基因表达量较RVVC-S组和RVVC-I组差异均无统计学意义(P>0.05)。其余几种药物的RVVC-S组、RVVC-I组和RVVC-R组菌株的CDR1、CDR2、PDR1、MDR1基因表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。

137株VVC致病白假丝酵母菌中，两性霉素B、咪康唑仅检出一株耐药菌株，与中敏菌株合并进行统计分析。结果显示:咪康唑不同敏感性菌株的CDR1基因表达在VVC-I+R组表达高于VVC-S组(P<0.05)；氟康唑不同敏感性菌株的CDR1基因表达在VVC-I组表达高于VVC-S组和VVC-R组(P<0.05)，但VVC-S组和VVC-R组无显著差异(P>0.05)。5-氟胞嘧啶和氟康唑的VVC-R组菌株的CDR2基因表达量与其VVC-S组和VVC-I组无显著差异(P>0.05)；伊曲康唑的VVC-R组CDR2和MDR1基因表达量与VVC-S组和VVC-I组无显著差异(P>0.05)。

进一步比较RVVC和VVC患者致病白假丝酵母菌株中不同抗真菌药物的敏感、中敏、耐药菌株组CDR1、CDR2、PDR1、MDR1基因表达量的差异，结果显示:两性霉素B的PDR1基因表达VVC-R组高于VVC-I组(P<0.05)；伊曲康唑的RVVC-R组的PDR1表达量显著高于VVC-S组、VVC-R组和RVVC-S组(P<0.05)，而VVC-S组、VVC-R组和RVVC-S组无明显差异(P>0.05)。其余各组MDR1、CDR1、CDR2和PDR1基因表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。RVVC、VVC不同药物敏感、中敏、耐药菌株MDR1、CDR1、CDR2和PDR1基因表达量情况,见表3。

表2 VVC组与RVVC组白假丝酵母菌药敏结果

表3 VVC组与RVVC致病菌株CDR1、CDR2、PDR1、MDR1与内参基因18SrRNA表达比较

3 讨 论

VVC患者的致病菌是以白假丝酵母菌为主。目前RVVC患者的主要致病菌是白假丝酵母菌，但是非白假丝酵母菌的构成日益增加，如光滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌等[5]。RVVC容易复发，不易根治，成为临床治疗的难点，这主要与RVVC患者的一些不良生活习惯、患糖尿病、免疫抑制和个体免疫差异有关[6-8]。目前认为，白假丝酵母菌的耐药机制与多种耐药基因的表达及其基因多态性有关，包括唑类药物作用靶酶编码基因ERG11碱基位点突变导致的结构及功能的改变、编码药物外排泵基因表达增加和某些耐药基因的表达、假丝酵母菌细胞膜的变化及生物膜形成等[9]。唑类药的药物外排泵基因表达异常被认为是唑类对假丝酵母菌属耐药的主要机制之一[10]。假丝酵母菌耐药为编码外排泵ATP结合转运蛋白超家族的白色假丝酵母菌耐药基因1(candida albicans drug resistance gene,CDR1)和白色念珠菌耐药基因2(candida albicans drug resistance 2,CDR2)。CDR1、CDR2和编码主要易化扩散载体超家族的多重耐药基因1(multiple drug resistance gene 1,MDR1)的过表达,药物外排泵对抗真菌药物的外排能力增强导致胞内药物浓度降低,可能是白色念珠菌最主要的耐药机制之一。PDR1是酿酒酵母同源的假丝酵母菌的外排泵基因，主要在光滑假丝酵母菌中表达[11]。

本研究对两组白假丝酵母菌进行药敏实验后，对213株致病白假丝酵母菌菌株进行了MDR1、CDR1、CDR2和PDR1基因的qPCR扩增，结果显示CDR1、CDR2和MDR1耐药基因在所有致病白假丝酵母菌中均有表达，白假丝酵母菌有PDR1的表达，但并不是所有菌株都表达。76株RVVC致病白假丝酵母菌中，PDR1表达率为19.74%；137株VVC致病白假丝酵母菌中，PDR1表达率为29.93%；RVVC组PDR1基因表达率明显低于VVC组(P<0.05)。在对RVVC和VVC的比较中，两性霉素B的VVC中敏、耐药合并组(I+R组)的PDR1表达率构成比明显高于VVC-S和RVVC-S组(P<0.05)。Whaley等[11]通过由于编码转录因子PDR1的基因突变而导致多药转运蛋白的过度表达,导致光滑念珠菌对唑类药物耐药。目前鲜有报道对白假丝酵母菌PDR1的检测并分析其耐药性。本研究发现，致病的白假丝酵母菌只有部分表达PDR1，并且在VVC中占的比例较大。提示PDR1基因在抗真菌药物不同敏感性菌株中的表达率存在一定差异，其在一些耐药菌株中的表达率增高，并验证了PDR1不仅是光滑假丝酵母菌耐药相关基因。耐药组PDR1基因的表达率和表达量均有所增加，PDR1基因可能是RVVC、VVC患者阴道致病白假丝酵母菌耐药的相关基因。推测PDR1可能对白假丝酵母菌的耐药起到一定的作用，但不是主要作用。

本研究通过比较RVVC和VVC患者致病白假丝酵母菌株中不同抗真菌药物的敏感、中敏、耐药菌株组CDR1、CDR2和MDR1基因表达量的差异，结果提示:RVVC和VVC患者致病白假丝酵母菌中，咪康唑和氟康唑的中敏、耐药菌株的CDR1基因表达明显较敏感菌株增高(P<0.05)，CDR1基因可能是RVVC、VVC患者阴道致病白假丝酵母菌耐药的相关基因。这与罗妙玲等[12]关于CDR1基因的报道一致。谭皓妍等[13]研究发现，某些白假丝酵母菌为多重耐药，而CDR1及CDR2高表达的白假丝酵母菌菌株与氟康唑耐药有关,与酮康唑或咪康唑耐药无关。本研究发现，在VVC致病白假丝酵母菌中，咪康唑不同敏感性菌株CDR1基因表达VVC-I+R组显著高于VVC-S组(P<0.05)；氟康唑VVC-I组CDR1基因表达显著高于VVC-S组和VVC-R组(P<0.05)。在RVVC致病白假丝酵母菌中，各组的CDR1、CDR2、和MDR1基因表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。结果提示，CDR1高表达可能参与了氟康唑和咪康唑的耐药，但尚未发现CDR2和MDR1在耐药菌株中的表达差异，这可能与样本量小有关。白假丝酵母外排泵基因表达特别复杂，对于CDR1、CDR2、MDR1和PDR1这几个外排泵基因，在耐药菌株中不一定同时表达,且与白假丝酵母菌对不同药物的耐药性相关[14]。研究显示，CDRs基因的一些改变导致使其表达量不均衡，如FLO8的缺失、H741D和Q1005H的基因突变[15-17]。

致VVC的白假丝酵母菌的耐药机制非常复杂，耐药相关基因CDR1、CDR2、PDR1和MDR1并不是耐药菌株特有的表达基因，它是一个多因素调节造成的结果，但在非耐药和耐药组之间的表达存在差异。并不是所有耐药基因都同时参与耐药，也非耐药一定就是外排泵高表达导致的。致VVC和RVVC的菌株之间并不是单纯的多次感染后必然耐药的关系。目前认为,阴道局部免疫功能异常可能与VVC和RVVC的发生密切相关[18]。故耐药基因的表达增加可能只是VVC和RVVC致病菌株耐药性产生原因之一。