HPLC法同时测定黄蜀葵花冠中芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量

2021-05-12朱俊豪贾红倩张彩梅颜军何钢

生物化工 2021年2期

朱俊豪，贾红倩，张彩梅，颜军，何钢*

（1.成都大学药学院四川抗菌素工业研究所药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室，四川成都 610106；2.北京天衡军威医药技术开发有限公司，北京 102600）

黄蜀葵[Abelmoschus manihot (L.)]是一种广泛分布于印度和中国南方多省的一年或多年生粗壮直立植物，别名黄秋葵、棉花葵、野芙蓉、鸡爪莲，为锦葵科秋葵属植物黄蜀葵的干燥花冠[1]。目前，黄蜀葵相关研究的着重点主要在种子和果实，而花瓣作为一种传统的中药材却研究较少[2-3]。近年来，黄蜀葵花因具有清热解毒、消肿活血等诸多功效而逐渐进入广大研究人员视野被广泛研究[4-7]。黄酮类化合物是黄蜀葵花冠中的主要活性物质之一，具有防治心脑血管疾病、抗菌、抗氧化和增强机体免疫等功效，而目前研究主要集中在探索总黄酮的提取工艺及其生物活性上，还鲜有黄酮成分研究的报道[8-11]。本实验建立了HPLC同时测定黄蜀葵花中芦丁、金丝桃苷和槲皮素3种黄酮成分的分析方法，为其质量标准的研究和相关产品的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

黄蜀葵花冠，购于成都市荷花池药材市场。

1.2 试剂与仪器

芦丁对照品（批号100080-200707），中国药品生物制品检定所；金丝桃苷对照品，成都普瑞法科技开发有限公司；槲皮素对照品（批号100081-200406），中国药品与生物制品检定所；乙腈，色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；磷酸、甲醇，分析纯，成都市科龙化工试剂厂；水为超纯水。

1260型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；FA2004B型电子分析天平，上海越平科学仪器有限公司；KQ-400KDE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；YB-1000A型粉碎机，永康市速锋工贸有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 对照品溶液配制

分别精密称取芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品0.10 mg、0.63 mg、0.23 mg，置于10 mL容量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，超声助溶，配成浓度分别为0.010 mg/mL、0.063 mg/mL、0.023 mg/mL的混合对照品贮备液。

1.3.2 供试品制备

取黄蜀葵花冠粉碎，过80目筛。称取黄蜀葵花冠粉约1.5 g，置50 mL容量瓶中，加入60%甲醇溶液50 mL，超声（功率70 W）提取10 min，室温放冷后，补充60%甲醇定容，振荡均匀，0.45 μm的滤膜过滤后进样。

1.3.3 样品含量测定

精密称取黄蜀葵花粉末1.5 g，按照“1.3.2”方法制备供试品溶液，稀释10倍进样，记录芦丁、金丝桃苷、槲皮素的峰面积，外标法计算含量。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：Waters Brownlee SPP-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，2.7 μm）；柱温：35 ℃；检测器：紫外检测器，检测波长 256 nm；进样量：10 μL；流速：0.7 mL/min；流动相A为乙腈，流动相B为0.2%磷酸溶液，梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱条件

1.3.5 方法学验证

（1）线性关系考察：将“1.3.1”项下混合对照品溶液，用60%甲醇逐级稀释成系列浓度的溶液，分别进样10 μL，以峰面积（mAU）为纵坐标，对照品浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，计算相关系数。

（2）精密度考察：精密吸取（1）项下中间浓度的混合对照品溶液，按照“1.3.3”项下的色谱条件，连续进样6针，记录每个对照品的峰面积，求得RSD值。

（3）稳定性考察：取同一供试品溶液，按照“1.3.4”项下的色谱条件分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h进样，记录3种成分的峰面积，测得芦丁、金丝桃苷、槲皮素峰面积的RSD值。

（4）重复性考察：按照“1.3.2”项下的条件，平行配制供试品溶液6份，按照“1.3.4”项下的色谱条件进样，记录峰面积，测得样品中芦丁、金丝桃苷、槲皮素的RSD值。

（5）加样回收考察：精密称取“1.3.2”项下处理的已知含量的金花葵粉末6份，每份约1.5 g，精密称定，60%甲醇定容至50 mL容量瓶中，分别精密加入一定量的芦丁（5.60 μg）、金丝桃苷（35.00 μg）、槲皮素（15.00 μg）对照品溶液，按照“1.3.3”项下的条件制备供试品溶液，稀释2倍进样测定峰面积，计算3种成分的RSD值和平均回收率。

2 结果与分析

2.1 色谱图分析

如图1所示，混合标准品出峰顺序为芦丁、金丝桃苷和槲皮素，图2中供试品各成分出峰位置与之对应。在“1.3.4”色谱条件下，芦丁、金丝桃苷和槲皮素分离效果良好，分离度均＞3.5，且理论塔板数均不低于200 00。

图1 混合对照品的高效液相色谱图

图2 供试品的高效液相图谱

2.2 样品含量测定

黄蜀葵花冠供试品中，芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量分别为0.39 mg/L、3.21 mg/L、0.87 mg/L，金丝桃苷含量最高。

2.3 方法学检测结果

2.3.1 线性关系

对芦丁、金丝桃苷和槲皮素标准品的线性范围进行考察，得到回归方程、相关系数和线性范围如表2所示，线性和范围结果均良好。

表2 各对照品的标准曲线

2.3.2 精密度考察

取“1.3.1”项下中间浓度的混合对照品溶液，连续进样6次，记录每个对照品的峰面积，求得RSD值。芦丁、金丝桃苷和槲皮素的RSD值分别是0.45%、0.12%和0.60%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性考察

取同一供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h进样检测，记录3种成分的峰面积，通过计算得芦丁、金丝桃苷、槲皮素峰面积的RSD值分别为1.63%、1.12%、1.95%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性考察

相同操作平行配制供试品溶液6份，按照“1.3.4”的色谱条件分别进样，记录峰面积，计算得到样品中芦丁、金丝桃苷、槲皮素的RSD值分别为0.38%、0.35%、0.71%，表明此方法的重复性良好。

2.3.5 加样回收考察

精密称取同一批已知含量的黄蜀葵花冠粉末6份，每份约1.5 g，精密称定，60%甲醇定容至50 mL容量瓶中，分别精密加入一定量的芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品溶液，按照“1.3.3”项下的条件制备供试品溶液，稀释2倍进样测定峰面积，计算3种成分的RSD值和平均回收率如表3所示。3个RSD值均较小，说明此测定方法稳定且可行性高。