壮药扶芳藤提取物调控骨代谢的体外实验研究*

史 明，张文捷，李 健，李同林，张 勇，罗 满

广西国际壮医医院/广西中医药大学附属国际壮医医院/广西壮瑶药技术研究中心,广西 南宁 530023

原发性I 型骨质疏松症（primary osteoporosis，PMOP）属于高转换型骨质疏松，雌激素替代疗法（estrogen replacement therapy，ERT）是目前临床治疗PMOP 的重要方法之一，其主要通过抑制破骨细胞活性而防治PMOP，临床应用已久，疗效可靠。壮药扶芳藤Euonymus fortunei（Turcz）Hand-Mazz 含有类雌激素样成分，这在一些研究中得到了证实。瞿发林等［1］、杨颖达［2］均从扶芳藤中提取到了黄酮苷类化合物，而黄酮类成分作为一种类雌激素成分，为防治PMOP 提供了一种新的可能。因此，本研究对扶芳藤提取物调控体外骨代谢的作用做了如下研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择出生后3～5 天的SD 大鼠6只，广西中医药大学动物实验中心提供，实验动物许可证号：SYXK 桂2019-0001。大鼠购进后饲以标准的大鼠合成饲料常规饲养，观察1 周无异常后进行实验。整个实验过程中动物自由摄食饮水，室温控制在20～25℃，相对湿度40%～60%。

1.2 试药与试剂扶芳藤提取物（自行制备），采用文献［3］中乙醇法提取纯化制作扶芳藤乙醇提取物浸膏；胰蛋白酶（上海兆吉生物科技有限公司，批号：140615）；最低基本（Minimum Essential Medium，MEM）培养基（Gibco 公司，批号：21700075）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）培养基（Gibco 公司，批号：16010-159）；羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanic acid，HEPES）缓冲液（上海信帆生物，批号：XFSJ-0087）；四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（Methyl thiazolyl tetrazoliun，MTT）细胞增殖试剂盒（北京富龙康泰，批号：FP-M-300）；抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resisatnt acid phosphatase，TRAP）检测试剂盒（上海碧云天生物技术研究所，批号：P0332）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养方法 采用大鼠颅盖骨机械法［4］体外分离培养获得成骨细胞（osteoblast，OB）；采用新生大鼠长干骨机械分离法［5］获得破骨细胞（osteoclast，OC）。

1.3.2 分组方法 采用随机数字表法分为观察组和对照组，观察组培养液为10%（体积分数）FBS+αMEM 培养液+高浓度扶芳藤提取物，对照组不加扶芳藤提取物。

1.3.3 促进骨形成的实验及检测方法 将高浓度扶芳藤提取物（扶芳藤乙醇提取物浸膏含量为200 mg/kg）加入到 OB 细胞培养箱中（48 孔培养板，每孔加入80 μL）。采用骨钙素免疫组化法和体外钙化能力实验进行0B 的鉴定，采用MTT 比色法检测0B 增殖。利用对硝基苯磷酸二钠基质动力学比色法（Para-nitrophenyl phosphate，pNPP）检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）含量及活性。

l.3.4 抑制骨吸收的实验及检测方法 将高浓度扶芳藤提取物加入到OC细胞培养箱中（48孔培养板，每孔加入80 μL）。根据试剂盒说明进行TRAP染色，鉴定OC并进行形态学观察。采用显微镜观察不同时间点骨片上吸收陷窝的变化，于培养第7 天对陷窝进行摄影，采用Mimics Medical 21.0 医学图像处理软件分析吸收陷窝面积。采用原子分光光度计法测定OC 培养液上清液中钙离子含量。

l.4 统计学方法数据采用PEMS 3.2 医学统计软件进行统计学处理，计量资料以表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OB 细胞周期及ALP 含量大鼠OB 在培养液中培养24、48、72 h后，观察组与对照组相比，各时相点均无明显差异（P＞0.05）。与对照组相比，观察组在 24、48、72 h 3 个时相点均能够提高 ALP 活性，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.2 骨吸收陷窝面积及钙离子含量加入高浓度扶芳藤提取物后，镜下见OC发生明显空泡性变，细胞轮廓模糊不清，TRAP着色不均匀。体外OC培养7 天后，观察组骨吸收陷窝面积明显缩小，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。体外OC培养7天后，观察组培养液上清液中钙离子含量下降，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表1 两组OB细胞周期、ALP含量及活性比较（）

表1 两组OB细胞周期、ALP含量及活性比较（）

组别观察组对照组例数12 12 OB细胞周期（%）ALP含量（μ/L）24 h 59.35±6.04 56.78±4.29 1.2017 0.2423 72 h 52.76±5.65 54.95±6.42 0.8871 0.3846 t P 48 h 53.48±7.08 54.62±3.76 0.5056 0.6182 24 h 29.42±3.16 18.37±2.59 9.3686 0.0000 48 h 56.33±6.03 24.62±3.48 15.7777 0.0000 72 h 68.57±8.12 28.42±4.39 15.0675 0.0000

表2 两组骨吸收陷窝面积及钙离子含量比较（）

表2 两组骨吸收陷窝面积及钙离子含量比较（）

组别观察组对照组例数12 12 t P骨吸收陷窝的面积（um2）0天569.42±75.45 628.36±86.59 1.7777 0.0893 7天106.49±25.15 2874.62±372.44 25.6883 0.0000钙离子含量（mg/L）0天66.72±6.39 68.31±7.24 0.5704 0.5742 7天46.05±5.47 67.62±6.85 8.5239 0.0000

3 讨论

扶 芳 藤 Euonymus fortunei（Turcz）Hand-Mazz为卫矛科卫矛属植物［6］，属于广西道地药材。扶芳藤入药首载于《本草拾遗》：“扶芳藤，味苦，小温，无毒，主一切血，一切气，一切冷，去百病，久服延年，变白，不老，大主风血”，可用于治疗风湿痹痛、腰肌劳损、吐血、血崩、创伤出血、月经不调、血瘀闭经、跌打骨折等，主要以茎叶入药，全年可采，在广西民间应用十分广泛，属于典型的壮药。《中药大辞典》记载：“补肾强筋，安胎，止血消瘀”“扶芳藤泡酒日服两次，治风湿疼痛”“扶芳藤治腰肌劳损、关节酸痛”，传统医学用其治疗肾虚腰痛、腰肌劳损、风湿痹痛、慢性腹泻、咯血、血崩、月经不调、跌打骨折、创伤出血等。《中国壮药资源名录》中记载［7］，扶芳藤微苦，热，通调龙路、火路，补气、血虚，强筋骨，止血，用于嘞内（血虚）、嘘内（气虚）、核難（腰肌劳损）、发旺（风湿痹痛），林得叮相（跌打损伤）、夺扼（骨折）、叮相噢嘞（创伤出血）、鹿嘞（吐血）、约京乱（月经不调）、贫淋嘞（崩漏）、嘚聚绥（落枕）。

扶芳藤虽为壮药，但是长期以来都是在中医药理论的指导下被广泛研究。陈曦［8］研究发现，复方扶芳藤合剂能在一定程度上降低骨破坏进展，可有效减少骨小梁的断裂，降低骨小梁间距。治疗作用和剂量有一定的依赖关系，从而推论出复方扶芳藤合剂对去卵巢大鼠引起的大鼠骨代谢具有积极影响。

成骨细胞和破骨细胞表面均有雌激素受体，它们分别是骨形成和骨分解代谢中的主要功能细胞。本研究结果表明，高浓度扶芳藤提取物可以提高成骨细胞ALP 的活性。ALP 是成骨细胞分化成熟的标记酶，是成骨细胞分化早期的重要生物学标志，在矿化过程中起着重要作用，是骨转换率的重要指标［9］。因此可以认为扶芳藤提取物对体外骨形成具有一定的促进作用。另一方面，高浓度扶芳藤提取物可引起体外破骨细胞形态学上的显著变化及骨吸收陷窝的面积降低，并引起OC 培养液上清液钙离子含量的下降，表明其对体外骨吸收有一定的抑制作用。此种表现与雌激素的作用特点相符。对扶芳藤的相关研究［10-12］表明，扶芳藤中存在一系列黄酮苷类成分，且含量较高，这类黄酮苷可被作为扶芳藤药材定量控制的指标性成分。李恩［13］对含有植物雌激素和黄酮类的多种中药进行了全方复方及拆方研究，发现含有黄酮类成分的中药普遍具有促进成骨细胞增殖、分化作用。李晶等［14］研究证实，含有此类成分的淫羊藿总黄酮可增强去势大鼠椎体的弹性，降低其脆性，具有抗骨质疏松的作用。叶丙霖等［15］通过文献总结了补肾活血类中药治疗绝经期骨质疏松症的作用机制，发现多种补肾活血中药发挥抗骨质疏松的作用机理主要依赖于其含有的类雌激素化合物以及对成骨、破骨细胞的作用。因此，让扶芳藤提取物能发挥雌激素替代疗法的作用从而防治PMOP成为一种临床可能。

综上所述，扶芳藤提取物可调控体外培养的破骨细胞及成骨细胞骨代谢，但其分子生物学机制有待进一步深入研究。