白刺果作用于白血病NB4 细胞的机制研究*

王 燕，谢亲建，马弢业，丁晓煜，王爱昕，潘 铭

1 武威市人民医院,甘肃 武威 733000；2 武警甘肃省总队医院；3 兰州大学药学院；4 西北民族大学第二附属医院

白血病是一种骨髓干细胞无限增殖的克隆性疾病，俗称为血癌。主要症状为流鼻血、面部苍白、食欲减退等。随着经济条件的发展和医疗技术的改变，学者对白血病的研究越来越多。白血病大致分为慢性和急性两种［1-2］，急性白血病多发生于儿童，而且发病率逐年上涨，根据国际治疗白血病的规划方案，治疗白血病的药物极少，且此病容易耐药，治愈率较低。以前人们无论用化学合成、物理提取的药物，还是从生物学的角度改变基因蛋白等，都无法从根本上治疗白血病。白刺果（Nitraria L.）常被用来治疗胃部不适等症状。现代药理学研究表明，白刺果对胃癌具有治疗作用。基于此，我们从分子生物学的角度研究白刺果对白血病细胞NB4 的影响，了解其对白血病细胞的抑制作用，为临床诊断提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 试药与试剂白刺果采摘于腾格里沙漠，经兰州大学生药学研究所马志刚教授鉴定为蒺藜科白刺属的灌木果实；小牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：22011-8612）；RPMI1640 培养基（Hyclone，SH30809.01）；NB4 细胞株（兰州大学药学院惠赠）；阳性对照药物亚砷酸钠注射液（哈尔滨医大药业股份有限公司，国药准字H19990191）。

1.2 仪器Sartorius 分析天平（SARTORIUSBT23S）；Thermo CO2培养箱（thermo-scientific公司）；Multiskan Spectrum 酶标仪（美国 Thermo Scientific公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 白刺果的制备 取白刺果500 g，清水冲洗、晒干；放入烧瓶，加入纯水500 mL，煎煮3次，每次1 h，蒸馏，合并滤液，比重为1.025～1.030 g/mL，待用。

1.3.2 细胞培养与MTT 检测 将冻存的白血病细胞株NB4 在37℃水浴中迅速融化，加入3 mL 培养液吹打后放入10 mL离心管中，离心半径：10 cm，1000 r/min，离心5 min，弃去上清液，用含有10%胎牛血清、双抗（100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素）的培养基中，在37℃，5%CO2培养箱中培养，整个过程在无菌环境中操作。取对数生长期的白血病细胞株NB4，用含10%小牛血清的RPM1640 培养液调整细胞密度至2.0×105/mL，接种至96 孔培养板，每孔100 μL。等待2 h 后，分别加入不同浓度（5、10、20、40 μg/mL）的白刺果浸取液100 μL，每个浓度设3个孔，并设对照组。分别于培养12、24、36 h 后每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 试剂 10 μL，继续培养4 h，弃上清液，加三联液，用酶联免疫检测仪以570 nm测量波长测定各孔吸光度（A），按以下公式计算：

抑制率（%）=（对照组-给药组）／对照组

1.3.3 PI 检测细胞周期 将白血病细胞株NB4调整至 2.0×105个/mL，接种于 6 孔板，每孔 3 mL。4 h后加入不同浓度的白刺果浸取液，每孔加入药物后终体积为1000 μL。培养24 h 后，收集细胞，离心半径：10 cm，1000 r/min，离心5 min，弃上清。预冷PBS 重悬细胞，离心洗涤3 次，用体积分数为70%的乙醇5℃固定过夜。上机前用PBS 溶液洗涤，加入PI 染色液（含RNA 酶5 mg/mL），终浓度为500 μg/mL，避光染色15～20 min，300 目尼龙网过滤后上流式细胞仪分析细胞DNA含量的变化。

1.3.4 免疫印迹法检测凋亡蛋白的表达 取对数生长期白血病NB4细胞，调整细胞密度为2.0×105个/mL，接种于 6 孔板，每孔 4 mL，30 min 后加入白刺果进行干预，作用24 h后收集细胞，每组细胞裂解液，于冰上裂解 25～30 min，12 000 r/min 离心后弃沉淀，收集上清，保存于-20℃备用。后续将分离的蛋白经过转膜，封闭，孵育，抗体的稀释比例分别为细胞色素c（Cytochrome C，Cmy-c）（1∶500），B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（1∶500），Caspase-3 家族（Pro-caspase3）（1∶500），β-actin（1∶500），一抗在 4℃的冰箱中孵育过夜，洗涤2 次，孵育二抗，再洗涤2 次，采用ECL发光液，采用胶片曝光形式。

1.4 统计学方法采用Excell 2007 录入数据，采用一般描述性分析。

2 结果

2.1 白血病NB4 细胞周期白刺果对白血病的抑制周期发生在G1期，这与三氧化二砷抑制白血病细胞的周期相一致。白刺果、三氧化二砷作用于白血病细胞凋亡显示，当白刺果和三氧化二砷的浓度为5 μg/mL时，抑制率分别为5.66%和47.6%；当白刺果和三氧化二砷的浓度为10 μg/mL 时，抑制率分别为25.68%和32.26%，相同浓度的白刺果对白血病细胞的抑制率低于三氧化二砷。见图1。

2.2 白血病NB4 细胞抑制率白刺果对白血病NB4 细胞具有抑制作用，随着时间的延续或浓度的递增，对白血病细胞的抑制率增高，当浓度为20 μg/mL时，抑制细胞的程度趋于平衡，这可能是细胞的增殖太快，药物浓度降低的缘故，另外，相同浓度的不同时间节点，药物作用的整个过程中，时间越长，抑制白血病细胞的效果越好，且抑制程度与浓度和时间具有正相关性。见图2。

2.3 白血病NB4 细胞凋亡蛋白的分析白刺果可以激活线粒体途径，对Cmy-c 或Bcl-2 起作用，随着浓度的升高，蛋白的表达下降见图3。

图1 对白血病细胞NB4细胞周期的影响

图2 不同浓度白刺果对白血病细胞NB4的抑制率

3 讨论

每年大约有18.5%的人死于白血病，近年来白血病的患病人群逐渐年轻化［3-6］。

通过本次实验和前期的研究可知，药物对细胞的抑制先是通过对细胞周期的调控［7-8］，细胞周期是任何一种细胞生命的特征，细胞周期也是发生恶性血液循环的主要原因之一；其次，药物对细胞的抑制是通过Caspase家族和Bcl-2家族系统，通过激活Pro-Caspase 途径，再进一步激活线粒体途径，从而阻断细胞的生长繁殖，达到抑制的效果，也就是促进了细胞的凋亡。白刺果抑制白血病NB4 细胞正是通过线粒体途径降低Cmy-C 和Bcl-2 蛋白的含量。另外，从白刺果的成分可知，白刺果中含有大量的黄酮化合物，黄酮化合物能够抑制调控细胞周期［9］，凋亡诱导肿瘤细胞，抑制细胞增殖，对于血液系统疾病来说，可调节血液细胞，影响血管生成［10-12］。基于此，白刺果对白血病的治疗作用，可能是黄酮类化合物在起重要作用，至于哪种黄酮类化合物起作用，有待于进一步研究。

图3 对白血病细胞NB4凋亡蛋白的影响