沉默IGFBP‐1对人胃肠道间质瘤GIST882细胞生长的影响及其作用机制

朱贤章 田伟力 田培力 李涛

胃肠道间质瘤（gastrointe stinalstromal tumor，GIST）是最常见的消化道间质肿瘤［1］，起源于胃肠道壁第四层的Cajal间质细胞，50%～70%发生在胃部，20%～30%发生于小肠［2⁃4］。手术是实现临床治愈的最佳疗法，然而，无论是大范围切除术还是局限性切除术，术后均有复发或转移风险，且GIST从良性转变为恶性过程较快［5⁃6］。此外，GIST的基因突变复杂多样，随着新突变位点的出现和化疗耐药性产生［7］，迫切需要新的特异性生物标志物进行临床病理鉴定，建立有效的预防、早期诊断和治疗策略。胰岛素样生长因子结合蛋白1（insulin⁃like growth factor binding protein 1，IGFBP⁃1）是IGFBP家族成员之一，能以高亲和力结合IGF而影响IGF⁃1和IGF⁃2的生物活性［8］。IGFBP⁃1主要由肝细胞合成，然后被分泌到血清中，还可由卵巢颗粒细胞、肾脏和孕妇蜕膜化子宫内膜产生［9］。研究表明，IGFBP⁃1能影响细胞代谢、分化和生长，血清IGFBP⁃1表达水平与多种慢性疾病密切相关，例如糖尿病、心血管疾病和结肠癌等［10⁃12］，然而，其在GIST中的研究少有报道。本研究探讨IGFBP⁃1对GIST细胞生物学行为的影响及其可能的作用机制，为GIST寻找新的诊断和治疗靶点

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2018年8月至2019年12月于新疆维吾尔自治区人民医院接受手术切除治疗的GIST患者45例的肿瘤组织及癌旁组织标本（距肿瘤边缘≥5 cm），病理类型均为腺癌，术前均未接受放化疗。危险度分级依据改良美国国立卫生院（NIH）分级标准：极低危险度3例，低危险度12例，中危险度14例，高危险度16例。本研究经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 主要材料与试剂

GIST882细胞购自上海赛利生物技术有限公司；IGFBP⁃1免疫组化染色试剂、胎牛血清、DMEM培养液以及胰蛋白酶购自美国HyClone公司；LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；EDU细胞增殖试剂盒购自英国Abcam公司，RNAiso Plus试剂、cDNA合成试剂盒与SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ购自日本TaKaRa公司；结晶紫染色液、CCK⁃8试剂盒、Transwell小室与Annexin V⁃FITC试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白测定试剂盒与化学发光液ECL购自北京索莱宝科技有限公司；抗体IGFBP⁃1、p⁃PI3K、PI3K、p⁃AKT、AKT、p⁃mTOR以及mTOR均购自美国SantaCruz Biotech公司；GAPDH与HRP标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；siRNA⁃IGFBP⁃1、阴性对照siRNA⁃NC以及基因引物序列均交由上海生工生物工程有限公司设计合成；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 免疫组化检测IGFBP⁃1表达

组织经固定、脱水、透明、石蜡切片、烘干脱水后，加入枸橼酸缓冲液煮沸进行抗原修复，3% H2O2溶液消除内源性过氧化物酶，山羊血清室温封闭30 min，滴加一抗（1∶200），4℃孵育过夜。次日，滴加二抗（1∶1 000），室温孵育30 min，冲洗后滴加二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片，电镜下观察并拍照。阳性细胞评分：阳性细胞比例＜5%记 0分；5%～25%记1分；26%～50%记2分；51%～75%记3分；＞75%记4分。染色强度评分：未着色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。两者相加分数＜2分判定为阴性，≥2分判定为阳性。

1.4 细胞培养、转染及分组

GIST细胞株GIST882用含10%胎牛血清（FBS），1%双抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）的DMEM，置于5% CO2、37℃培养箱中常规传代培养，待细胞生长覆盖至培养基底部80%，使用0.25%胰蛋白酶消化，选择对数生长期的细胞用于后期实验。

GIST882细胞按1×105/孔接种于6孔板中，按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书方法，分别转染siRNA⁃NC、siRNA⁃IGFBP⁃1，记为 siRNA⁃NC 组和siRNA⁃IGFBP⁃1组，并设置空白对照组，孵育 4 h后更换为DMEM新鲜培养基。

1.5 qRT⁃PCR检测IGFBP⁃1 mRNA的表达

根据RNAiso Plus试剂说明提取各组GIST882细胞的总RNA，NanoDrop2000紫外分光光度计检测RNA的纯度、浓度。逆转录试剂盒反转录成cDNA，参照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明，并以cDNA为模板进行qRT⁃PCR实验。扩增条件：95℃5 min，1个循环；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s，40个循环。实验重复 3次。以GAPDH为内参，用2−ΔΔCt法计算基因表达水平。引物序列：IGFBP⁃1上游引物5'⁃TCGATCTT⁃TACCCATCCTTCCT⁃3'，下游引物 5'⁃ATCGATATG⁃GAGGACATGACGGTGG⁃3'；GAPDH 上游引物 5'⁃GGTGAAGGTCGGTGTGAAC⁃3'，下游引物 5'⁃AGAT⁃GGTGATGGGCTGCCC⁃3'。

1.6 Western blot检测蛋白表达水平

RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量后，取25 μg总蛋白上样，10% SDS⁃PAGE分离，转移至PVDF膜。TBST洗涤3次，5%山羊血清封闭 2 h，洗涤并加入一抗 IGFBP⁃1（1∶500），p⁃PI3K、PI3K、p⁃AKT、AKT、p⁃mTOR及mTOR（均1∶1 000），4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入HRP标记山羊抗兔IgG（1∶5 000）为二抗，室温孵育2 h。滴加ECL 发光液显影，Image J图像分析软件统计各条带灰度值，并以GAPDH为内参，计算蛋白表达水平。

1.7 CCK⁃8法检测细胞活性

GIST882细胞按1×104/孔接种于96孔板上，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中过夜培养，按照1.4进行细胞转染，每孔设置3个复孔，分别于转染后24 h、48 h和 72 h，每孔加入 10 μL CCK⁃8 试剂继续培养4 h，采用全自动酶标仪检测450 nm处各孔细胞的光密度（OD）值。

1.8 EDU检测细胞增殖能力

将转染后的GIST882细胞以2×105/孔接种在24孔板中，培养12 h，滴加EDU至终浓度为10 μmol/L继续培养2 h，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton X⁃100穿透20 min，Apollo567避光染色30 min，滴加DAPI染核5 min。中性树胶封片，在激光共聚焦显微镜下观察细胞，其中蓝色荧光为细胞核，红色荧光为EDU阳性细胞。

1.9 Annexin V⁃FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡能力

GIST882细胞转染后，消化离心后将细胞重悬于结合缓冲液中，在细胞悬浮液加入5 μL Annexin V⁃FITC混匀，混匀后再加入10 μL PI染色液，室温下置于黑暗环境温育30 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况，实验重复3次。

1.10 Transwell检测细胞迁移与侵袭能力

在Transwell小室的上室加50 μL稀释的Matrigel胶，置于37℃培养箱40 min后，将转染后的GIST882细胞调整为 1×106/mL，取 100 μL 细胞悬液加入Transwell上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培养液培养至细胞贴壁，换无血清培养液培养12 h，孵育12 h，取出后用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色10 min，PBS洗涤，中性树胶封片，显微镜下拍照并统计细胞数目。迁移实验没有铺Matrigel胶步骤，其他操作均与侵袭实验相同。

1.11 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据分析处理，计量资料均采用均数±标准差（±s）表示，多样本比较采用单因素方差分析，组间样本比较采用LSD⁃t检验；IGFBP⁃1阳性表达率在GIST组织和癌旁组织的比较采用配对χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IGFBP⁃1在GIST组织和癌旁组织中的表达

免疫组化检测结果显示，GIST组织中IGFBP⁃1阳性表达率高于癌旁组织，差异有统计学意义（86.67%vs11.11%，P＜0.05），见图1。

图1 GIST组织和癌旁组织中IGFBP‐1表达（IHC，左40×，右400×）Fig.1 IGFBP‐1 expression in GIST tissues and paracancerous tissues（IHC,Left 40×,Right 400×）

2.2 转染后GIST细胞中IGFBP⁃1的表达

qRT⁃PCR和Western blot检测结果显示，与空白对照组和siRNA⁃NC组比较，siRNA⁃IGFBP⁃1组IGFBP⁃1 mRNA相对表达量和蛋白表达量均显著降低（均P＜0.05），见图2。说明细胞转染成功。

图2 GIST细胞中IGFBP‐1的表达Fig.2 Expression of IGFBP‐1 in GIST cells

2.3 沉默IGFBP⁃1对GIST细胞增殖活性的影响

CCK⁃8法检测结果显示，转染24 h、48 h、72 h后，与空白对照组和siRNA⁃NC组比较，siRNA⁃IGFBP⁃1组细胞增殖活性均显著下降（P＜0.05），见图3。EDU染色结果显示，siRNA⁃IGFBP⁃1组细胞中EDU阳性细胞率［（38.25±3.15）%］较空白对照组［（69.42±6.11）%］和 siRNA⁃NC组［（71.56±7.04）%］均显著降低（均P＜0.05），见图4。

图3 GIST细胞不同时间点的细胞增殖活性Fig.3 Proliferative activity of GIST cells at different time points

图4 EDU染色检测GIST细胞增殖情况（100×）Fig.4 Proliferation of GIST cells detected by EDU staining(100×)

2.4 沉默IGFBP⁃1对GIST细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，与空白对照组［（4.79±0.41）%］和siRNA⁃NC组［（4.20±0.39）%］比较，siRNA⁃IGFBP⁃1组细胞凋亡率显著增加［（24.12±2.03）%］（均P＜0.05），见图5。

图5 流式细胞术检测GIST细胞凋亡情况Fig.5 Apoptosis of GIST cells detected by flow cytometry

2.5沉默IGFBP⁃1对GIST细胞迁移与侵袭能力的影响

Transwell小室实验结果显示，与空白对照组和siRNA⁃NC组比较，siRNA⁃IGFBP⁃1组细胞迁移数目和侵袭数目均显著减少（均P＜0.05），见图6。

图6 Transwell实验检测GIST细胞迁移与侵袭能力Fig.6 The migration and invasion of GIST cells detected by Transwell assay

2.6 沉默IGFBP⁃1对GIST细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，siRNA⁃IGFBP⁃1组细胞中p⁃PI3K/PI3K、p⁃AKT/AKT及p⁃mTOR/mTOR的比值较空白对照组和siRNA⁃NC组显著下降（均P＜0.05），而空白对照组与siRNA⁃NC组细胞中p⁃PI3K/PI3K、p⁃AKT/AKT及p⁃mTOR/mTOR的比值比较差异无统计学意义（均P＞0.05），见图7。

图7 Western blot检测GIST细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达Fig.7 The expression of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway related proteins in GIST cells detected by Western blot

3 讨论

GFBPs作为一种分泌蛋白，最初研究表明其通过隔离血清和细胞外液中的IGFs而发挥IGF信号调节剂作用［8］。近年来，随着研究不断深入，在一些疾病和肿瘤组织或血清中也检测到IGFBP表达，例如乳腺癌组织中IGFBP表达高于邻近正常组织，且IGFBP在乳腺癌组织的恶性转化中发挥一定作用［13］。卵巢癌组织和血清中也检测到较高水平的IGFBP⁃1表达，且晚期患者中IGFBP⁃1水平更高，IGFBP⁃1还在卵巢透明细胞腺癌中特异性表达［14⁃15］。本研究也发现 IGFBP⁃1在GIST组织中呈高表达，由此推测IGFBP⁃1可能参与GIST的发生发展过程。多项研究还报道IGFBP⁃1通过与细胞表面分子相互作用而调节细胞增殖、黏附、凋亡、迁移和侵袭过程［16⁃20］。本研究进一步通过转染siRNA⁃IGFBP⁃1沉默GIST细胞中IGFBP⁃1表达，结果发现沉默后细胞增殖、迁移及侵袭能力下降，并促进细胞凋亡，说明沉默IGFBP⁃1表达对GIST细胞生长具有抑制作用。

PI3K/AKT/mTOR信号通路参与多种细胞活动，与细胞周期、细胞增殖及凋亡等密切相关。既往研究发现，在恶性肿瘤中PI3K/AKT/mTOR信号通路的异常激活可增强肿瘤细胞活性，促进细胞生长和蛋白质合成，从而促进癌症的发展，而抑制此信号通路激活可产生相反作用［21⁃22］。在 GIST 组织中，研究发现PI3K和AKT高表达，且随着GIST恶性程度加重而表达增加［23］。本研究检测GIST细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达，发现沉默IGFBP⁃1表达后，细胞中PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平明显下降，说明在GIST细胞中下调IGFBP⁃1表达可阻碍PI3K/AKT/mTOR信号通路激活，从而抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为，阻止肿瘤发展与恶化。

综上所述，GIST组织中IGFBP⁃1高表达，沉默IGFBP⁃1表达可抑制GIST细胞增殖、侵袭与迁移，并诱导细胞凋亡，其机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活有关，本研究结果为GIST治疗提供了新的靶点和思路。