高效液相色谱串联质谱法测定红糖中5-羟甲基糠醛

庞扬海，高裕锋*，甄振鹏，黄敏兴，余构彬

(1广东省科学院生物工程研究所，广东广州 510316；2中国轻工业甘蔗制糖工程技术研究中心，广东广州 510316)

0 引言

5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural, 5-HMF)是美拉德反应的主要副产物之一[1]。现有研究表明，5-HMF对人体有潜在的危害，摄入过量的 5-HMF可能会造成横纹肌麻痹和内脏损害，甚至可能会导致体内基因突变[2-3]。红糖是以甘蔗为原料，经提取糖汁，清净处理后，直接煮炼不经分蜜制炼而成的食糖[4-6]。在红糖的生产煮炼过程中容易发生美拉德反应[7]，从而产生 5-HMF[8]。建立一个准确测定红糖中 5-HMF的方法，用于准确监测红糖中 5-HMF的含量显得十分重要。

目前，食品中5-HMF的检测方法有高效液相色谱法[9-10]、液相色谱-质谱法[11-12]和气相色谱-质谱法等[12-13]。采用高效液相色谱法检测红糖样品中的5-HMF也已有报道[14]，但该方法检出限为 0.05 mg/kg，其灵敏度低，容易出现假阳性。高效液相色谱串联质谱法将色谱与质谱联用，与高效液相色谱法比较，可以有效提高检测的灵敏度和准确性。本文将采用超高效色谱串联质谱法建立适用于红糖中5-HMF的检测方法，并应用此方法调研目前市面上销售的红糖中5-HMF的含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AB 5500 Q-Trap高效液相色谱串联质谱仪(美国AB SCIEX公司)；Milli-Q超纯水器(美国密理博公司)；H1850R台式高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；WIGGENS Vortex3000涡旋振荡仪(北京桑翌实验仪器研究所)；N-EVAP112氮吹仪(美国 Organomation公司)；JE3002GE电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；XPE105电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

5-HMF(98.0%，农业农村部环境保护科研监测所)；甲醇(色谱纯，德国默克股份两合公司)；乙腈(色谱纯，德国默克股份两合公司)；0.22 μm有机相滤膜(彼西络科技(广州)有限公司)；HLB固相萃取柱(3 mL，60 mg，美国沃特世公司)；PEP 固相萃取柱(3 mL，60 mg，天津博纳艾杰尔科技有限公司)；C18固相萃取柱(3 mL，200 mg，广州太玮生物科技有限公司)。红糖样品均在市场上随机购买。

1.2 标准溶液配制

准确称取5-HMF标准品10.20 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈-水溶液(V/V=1/9)定容至刻度，配制成浓度为1000 mg/L的标准储备溶液，于4℃下避光保存。取上述标准储备溶液进行逐级稀释，用乙腈-水溶液(V/V=1/9)定容，配制成浓度分别为50.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/L的标准系列溶液。

1.3 提取和净化

准确称取5.00 g红糖样品于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇-水溶液(V/V=5/95)，充分涡旋5 min，静置(若有沉淀，以4900 r/min的转速离心5 min)取4 mL上清液，待净化。取待净化液过已活化后的HLB柱，先用 2 mL甲醇-水溶液(V/V=5/95)淋洗，弃去淋洗液，再用6 mL甲醇洗脱并收集洗脱液。经氮气吹干后，用1 mL乙腈-水(V/V=1/9)充分溶解，混合均匀，过0.22 μm滤膜，根据实际浓度适当稀释至标准曲线线性范围内，供液相色谱-质谱联用仪分析。

1.4 LC-MS/MS分析

1.4.1 LC条件

色谱柱：Phenomenex Luma Omega C18柱(1.6 μm，100 mm×2.1 mm)；进样量：2 μL；柱温箱温度45℃；流动相 A：水，流动相 B：甲醇；梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件

电离模式：ESI+；仪器参数：气帘气压力275.8 kPa，碰撞气档位中档，离子源电压5500.0 V，离子源温度550℃，喷雾气压力344.8 kPa，辅助加热气压力344.8 kPa，接口加热为开；采集模式：多反应监测MRM，具体参数如表2所示。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件选择

表2 5-羟甲基糠醛的MRM质谱参数

本研究对比了Phenomenex Luma Omega C18柱(1.6 μm，100 mm×2.1 mm)和 Phenomenex Kinetex XB-C18柱(2.6 μm，100 mm×2.1 mm)对 5-HMF 的分析效果，结果发现 5-HMF在 Phenomenex Kinetex XB-C18柱的出峰较快；而在 Phenomenex Luma Omega C18柱出峰较慢，峰型尖锐。由于红糖中主要含的蔗糖、葡萄糖和果糖等是极性较大的物质，在C18色谱柱上保留弱，为了避免目标物和这些杂质同时洗脱出来而导致基质效应，所以本研究使用对5-HMF保留强和峰型更尖锐的 Phenomenex Luma Omega C18柱。

对比了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水作为流动相体系对5-HMF分析效果的影响。使用甲醇-水体系比使用乙腈-水体系5-HMF的保留时间更晚，峰型更对称和尖锐，响应更高。使用甲醇-水体系和使用甲醇-0.1%甲酸水体系相比，响应相差不大，但是甲醇-0.1%甲酸水体系目标峰出现后拖尾现象。因此本文选取甲醇-水作为流动相体系。

质谱条件优化方法是：在注射泵直接进样的条件下，在正离子模式下进行母离子全扫描，确定5-HMF的分子离子峰，然后以该分子离子峰为母离子，对其子离子进行全扫描，获得二级质谱响应较强的2个子离子，最后以多反应监测模式进行采集，并获得去簇电压和碰撞能量等相关参数[15]，具体参数如表2所示，使所测的质谱峰强度最优。

在上述优化的色谱和质谱条件下，获得的5-羟甲基糠醛标准溶液(20 μg/L)总离子流色谱图如图1所示。

图1 5-羟甲基糠醛标准溶液(20 μg/L)的总离子流色谱图

2.2 提取溶液和净化方式选择

本研究比较了甲醇-水(V/V=5/95)、甲醇-水(V/V=1/9)、甲醇-水(V/V=2/8)、乙腈-水(V/V=5/95)、乙腈-水(V/V=1/9)和乙腈-水(V/V=2/8)对红糖中5-HMF提取效率的影响，结果表明甲醇-水(V/V=5/95)和乙腈-水(V/V=5/95)的提取效果相当而且优于其他4种溶液，综合毒性和价格考虑，选用毒性相对较小和价格较便宜的甲醇-水为提取溶剂。

红糖的主要成分是蔗糖、色素和氨基酸等[7,16-17]，净化除去这些物质，既有利于提高5-HMF的回收率又可以延长色谱柱寿命。HLB柱、PEP柱和C18柱均能吸附5-HMF，通过淋洗液淋洗可以除去大部分极性比5-HMF大的蔗糖、色素和氨基酸等杂质。因此本文通过加标回收实验比较了使用这3款固相萃取柱的净化效果和5-HMF的回收率。结果表明使用这3款固相萃取柱的净化后，得到的上机待测液均是澄清透明的，使用HLB柱所得到的5-HMF的回收率优于PEP柱和C18柱。因此选择使用HLB柱净化红糖样品。

2.3 方法线性范围和检出限

配制浓度为 50.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/L的标准系列溶液，按1.4的仪器方法分析，以5-HMF的浓度为横坐标(x)，各浓度对应的峰面积为纵坐标(y)，获得目标物的线性方程和相关系数，见表3。

加标后的空白红糖样品经过前处理得到的样液，按 1.4的条件与方法进行分析，根据信噪比为3(S/N=3)和样液的稀释倍数计算得到检出限(LOD)，根据信噪比为 10(S/N=10)和样液的稀释倍数计算得到定量限(LOQ)。结果显示，红糖样品中 5-羟甲基糠醛检出限为 0.44 μg/kg，定量限为 1.47 μg/kg，见表3。

表3 5-羟甲基糠醛的方法检出限、定量限、线性范围、线性方程和相关系数

2.4 回收率和精密度

取红糖样品，分别在2.0、5.0、10.0 μg/kg浓度水平下加标，每个浓度分别做6个平行实验，计算得到在各个加标水平下5-HMF的回收率在86.3%～97.8%范围内，精密度在 2.1%～5.0%范围内，详见表4。

表4 红糖中5-羟甲基糠醛平均回收率和精密度数据表(n=6)

2.5 实际样品测试

按照本研究建立的方法，对在市面上随机购买的25份红糖样品进行检测，结果显示这25份红糖样品均检出5-HMF，含量范围为 6.43～533 μg/kg。这表明红糖样品在生产过程中确实会产生 5-HMF；参照《中国药典(一部)》对蜂蜜日食用量为15～30 g，5-HMF含量不得超过 0.004%的规定[18]，目前测得的红糖中 5-HMF残留值对人体可能产生的健康风险是较低的。

3 结论与讨论

本研究建立了红糖中5-羟甲基糠醛的高效液相色谱串联质谱检测方法。结果表明，5-HMF在0.5～50.0 μg/L范围内线性关系良好，该方法检出限为0.44 μg/kg，定量限为 1.47 μg/kg；在 2.0、5.0、10.0 μg/kg浓度水平下加标，平均回收率为 86.3%～97.8%。本方法操作简单、灵敏度高、准确性和净化效果好，适用于红糖中5-HMF的残留量测定。需要补充说明的是，本研究暂未对日间回收率和日间精密度进行研究，这将在日后的进一步研究中进行优化。