基于谱效关联分析的吴茱萸抗炎活性的质量标志物研究

惠 慧，陈祺松，田 港，单琪媛*，秦路平*

• Q-Marker研究 •

基于谱效关联分析的吴茱萸抗炎活性的质量标志物研究

惠 慧1，陈祺松2，田 港1，单琪媛1*，秦路平1*

1. 浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 311402 2. 宁波市鄞州区第二医院，浙江 宁波 315192

采用谱效关联分析方法探索吴茱萸抗炎活性的质量标志物（quality marker，Q-Marker），为其抗炎活性的质量控制提供依据。采用超高效液相色谱（UPLC）对24批吴茱萸药材进行指纹图谱分析；以脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7建立体外炎症细胞模型，考察24批吴茱萸药材对细胞上清液中一氧化氮（nitric oxide，NO）以及细胞内诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide-synthase，iNOS）水平的影响；采用SPSS软件关联指纹图谱色谱峰峰面积与抗炎活性的关系，并采用UPLC-四级杆飞行时间质谱（QTOF-MS）对吴茱萸的抗炎活性成分进行指认。24批吴茱萸药材对RAW264.7细胞上清液NO抑制率为12%～82%，谱效关联分析共筛选出14个吴茱萸潜在抗炎成分，分别为吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱等吲哚喹唑啉类生物碱以及奎宁酸类成分、绿原酸类成分、喹诺酮类生物碱等。与模型组比较，柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、奎宁酸、去氢吴茱萸碱、二氢吴茱萸卡品碱、绿原酸、隐绿原酸可显著抑制RAW264.7细胞上清液中NO水平及细胞内iNOS水平（＜0.05、0.01）。柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、奎宁酸、去氢吴茱萸碱、二氢吴茱萸卡品碱、绿原酸和隐绿原酸为吴茱萸抗炎活性的Q-Marker。

质量标志物；吴茱萸；超高效液相色谱；抗炎；谱效关联分析；柠檬苦素；吴茱萸碱；吴茱萸次碱；奎宁酸；去氢吴茱萸碱；二氢吴茱萸卡品碱；绿原酸；隐绿原酸

吴茱萸作为一种传统中药，最早收录于《神农本草经》，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻等功效，广泛应用于临床[1]。吴茱萸在我国分布较为广泛[2]，然而由于其生长环境、采收时期、种植管理等因素差异，不同地区、批次药材的化学成分和生物学特性也存在差异[3]。《中国药典》2020年版仅规定了吴茱萸中柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱的含量标准，对其药效的质量评价参考较为局限。在中药材来源、产地、种植条件多样的特点下，如何科学、合理地评价中药质量成为目前亟待解决的问题。基于现有质量评价与控制方法存在的问题，刘昌孝院士[4]提出中药质量标志物（quality marker，Q-Marker）的新概念。Q-Marker策略目前已广泛应用于中药材的质量评价中[5-13]。陈洋等[14]运用Q-Marker方法发现吴茱萸止呕效果与芦丁、柠檬苦素、金丝桃苷、异鼠李素-3--芸香糖苷、柯伊利素-7--芸香糖苷、异鼠李素-3--β--半乳糖苷、1-甲基-2-正十一烷基-4-(1)-喹诺酮、1-甲基-2-[()-4-壬烯基]-4-(1)-喹诺酮有关；潘学强等[15]通过谱效相关分析发现吴茱萸汤偏头痛疗效与人参皂苷Rg1、吴茱萸苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱相关。Q-Marker为明确吴茱萸药材及其复方药效与成分间的内在关系以及制定科学的质量标准提供基础。中药具有多成分、多靶点的特点，其药效往往是多种成分共同作用的结果，目前大多数中药的药效及毒性物质基础尚不明确。中药指纹图谱能全面表征中药的化学特征[16-18]，从整体上反馈药材的质量。以中药指纹图谱为成分表征，结合细胞活性筛选，建立成分与药效间的关联，可以客观、合理地反映药材内在质量。

在机体的炎症过程中，巨噬细胞被激活，产生炎症反应，免疫细胞可释放炎症介质和促炎细胞因子，炎症介质的过度表达可进一步加重炎症反应，诱发关节炎、痴呆、心血管疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病、癌症等多种慢性疾病[19]。现代药理学研究表明，吴茱萸乙醇提取物能够预防脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的内毒素血症大鼠的循环衰竭、血管对苯肾上腺素的低反应性、肝功能障碍等症状，并抑制血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）的过量产生，且呈剂量相关性[20]。Woo等[21]发现吴茱萸中的主要活性成分吴茱萸次碱能够抑制小鼠单核巨噬细胞RAW264.7中前列腺素的生成。课题组前期研究发现，吴茱萸醇提物对角叉菜胶致足肿胀、二甲苯致耳肿胀小鼠模型均有显著的抗炎作用[22]。因此，本研究采用指纹图谱结合细胞炎症模型，筛选吴茱萸潜在的抗炎活性成分为Q-Marker，为药效导向的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 细胞

RAW264.7细胞购自中国科学院细胞库。

1.2 药材

分别于2017年、2018年、2019年从湖南、浙江、江西、贵州、广西等地采集24批吴茱萸药材（表1），经浙江中医药大学药学院陈孔荣教授鉴定均为芸香科植物吴茱萸(Juss.) Benth.的干燥近成熟果实。

1.3 药品与试剂

柠檬苦素对照品（批号H23J9K65962，质量分数≥98%）、LPS购自上海源叶生物科技有限公司；对照品去氢吴茱萸碱（批号DSTDQ013601，质量分数≥98%）、吴茱萸碱（批号MUST-18031410，质量分数≥99.87%）、吴茱萸次碱（批号MUST-18031411，质量分数≥99.18%）购自成都曼斯特生物科技有限公司；色谱级甲醇、乙腈购自美国Tedia公司；分析级无水乙醇购自广东光华科技股份有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；细胞裂解液（批号031020200604）、蛋白酶抑制剂（批号101620201209）、BCA蛋白定量试剂盒（批号082820201207）、NO测定试剂盒（批号090420201111）购自上海碧云天生物科技有限公司；小鼠诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide-synthase，iNOS）ELISA试剂盒（批号202103）购自江苏酶免实业有限公司。

表1 24批吴茱萸药材中主要成分的质量分数

1.4 仪器

Acquity超高效液相色谱（UPLC）H-Class超高效液相色谱系统（美国Waters公司）；Milli-Q超纯水处理系统（德国Merck公司）；KQ300DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；1510型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；半微量天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Acquity BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～0.3 min，6.0% A；0.3～5.0 min，6.0%～8.0% A；5.0～8.0 min，8.0%～14.5% A；8.0～15.5 min，14.5%～22.0% A；15.5～18.5 min，22.0%～48.0% A；18.5～20.5 min，48.0% A；20.5～23.5 min，48.0%～70.0% A；23.5～25.5 min，70.0% A；25.5～27.5 min，70.0%～95.0% A；27.5～29.0 min，95.0% A；29.0～29.2 min，95.0%～6.0% A；29.2～31.0 min，6.0% A；体积流量为0.4 mL/min；进样量为0.5 μL；自动进样器温度为20 ℃；柱温为（30±5）℃；检测波长为254 nm；检测器为光电二极管阵列。

2.2 样品溶液和对照品溶液的制备

2.2.1 样品溶液的制备 将吴茱萸药材打粉，精密称定5.00 g吴茱萸粉末置100 mL锥形瓶中，加入50 mL 70%乙醇，混匀静置1 h，超声提取40 min，滤过，采用旋转蒸发仪浓缩，于5 mL量瓶定容。取0.075 mL溶液，以70%乙腈稀释至1.5 mL，经0.22 μm滤膜滤过后进样，用于UPLC分析；取2.5 mL溶液采用旋转蒸发器蒸干，用2.5 mL 50% DMSO溶解，于−20 ℃保存，用于细胞实验。

2.2.2 对照品溶液的制备 去氢吴茱萸碱为吴茱萸中主要活性成分吴茱萸碱和吴茱萸次碱的结构类似物，具有良好的抗炎活性[23]，且在吴茱萸中质量分数较高，因此本研究增加去氢吴茱萸碱为待考察定量成分。分别称取柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱对照品4.16、3.86、4.54、8.10 mg置10 mL量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，得到对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线的制备 去氢吴茱萸碱、柠檬苦素和吴茱萸次碱的最大吸收波长为216 nm，吴茱萸次碱的最大吸收波长为225 nm。将对照品溶液梯度稀释，按“2.1”项下色谱条件进样分析，以对照品质量浓度为横坐标（），各成分色谱峰峰面积为纵坐标（），进行线性回归，得到标准曲线方程。去氢吴茱萸碱回归方程为＝5 195.50－10 414.00，线性范围为810.00～1.58 μg/mL；柠檬苦素回归方程为＝587.23－312.16，线性范围为416.00～3.25 μg/mL；吴茱萸碱回归方程为＝9 711.50＋2 003.30，线性范围为386.00～0.37 μg/mL；吴茱萸次碱回归方程为＝7 179.80＋6 056.30，线性范围为454.00～3.55 μg/mL；所有回归方程均≥0.999 0。

2.3.2 精密度试验 取吴茱萸样品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱色谱峰峰面积的RSD分别为0.98%、1.63%、0.49%、0.68%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 按“2.2.1”项下方法制备6份同一批次吴茱萸样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。各成分色谱峰峰面积的RSD均小于2.66%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取吴茱萸样品溶液，按“2.1”项下色谱条件，于0、1、2、4、6、8、10、12、16、18、24 h进样分析。各成分色谱峰峰面积的RSD均小于1.43%，表明样品溶液在室温下24 h内稳定。

2.3.5 加样回收率试验 精密称定2.50 g吴茱萸粉末6份，分别加入去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品，按“2.2.1”项下方法制备吴茱萸样品溶液，进样测定，记录色谱图。各成分加样回收率为95.97%～104.65%，去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱色谱峰峰面积的RSD分别为0.99%、3.33%、0.80%、1.72%。

2.3.6 样品中各成分的含量测定 取24批吴茱萸药材，按“2.2.1”项下方法平行制备3份样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，计算吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱的质量分数，见表1。

2.4 24批吴茱萸药材指纹图谱的建立与分析

将24批吴茱萸的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版），以S13批次的吴茱萸药材指纹图谱为参照，采用中值法生成对照指纹图谱，经多点校正和自动匹配后生成吴茱萸指纹图谱见图1。R相近、峰形相同的色谱峰被认为是具有指纹图谱意义的共有峰，从图1可以看出，有28个共有峰，占总峰面积的90%以上，不同批次的吴茱萸药材中成分不同，各成分的质量分数也不同，可以用于谱效相关分析。其相似度分析结果见表2，各批次吴茱萸与对照指纹图谱相似度为0.658～0.959，表明24批吴茱萸药材存在一定差异。

图1 24批吴茱萸药材的UPLC指纹图谱

表2 24批吴茱萸药材指纹图谱相似度分析

2.5 24批吴茱萸药材体外抗炎活性的测定

2.5.1 细胞培养 RAW264.7细胞用含1%双抗、10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，融合度达到70%～80%进行传代。

2.5.2 细胞活力的测定 RAW264.7细胞以4×105/mL接种于96孔板中，100 μL/孔，培养6 h。设置对照组、模型组、地塞米松（5 μmol/L）组和吴茱萸（0.4 mg/mL）组，各给药组加入相应药物预处理2 h后，模型组及各给药组再加入LPS（1 μg/mL），对照组加入不含药物的培养基，培养40 h。弃去上清液，加入含10% CCK8的无血清DMEM培养基，于37 ℃孵育，采用酶标仪于450 nm处测定吸光度（）值。结果如图2所示，42 h内85%以上批次吴茱萸药材对RAW264.7细胞活力无明显影响。

2.5.3 细胞上清液中NO水平的测定 按“2.5.2”项下方法处理细胞，按照试剂盒说明书测定细胞上清液中NO水平。结果如表3所示，不同批次的吴茱萸药材的抗炎作用有较大差异，浙江、广西产地的吴茱萸（S9～S15、S23、S24批次）抗炎作用较强，NO抑制率达60%以上，湖南邵阳产地的吴茱萸（S5批次）抗炎作用较弱，NO抑制率为12%，可能由于吴茱萸的采摘及储存时间、果实成熟度和生长环境的不同，导致不同批次、地区的吴茱萸中化学成分发生变化，进而造成了各批次吴茱萸药材抗炎活性的差异。因此，关于24批吴茱萸药材的信息可以进行后续谱效相关性分析。

图2 24批吴茱萸药材对RAW264.7细胞活力的影响()

表3 24批吴茱萸药材对RAW264.7细胞的NO抑制率()

2.6 谱效相关分析

Pearson相关系数是一种统计方法，可以定量地度量变量之间的相关性，广泛应用于谱毒或谱效的相关分析。在谱效相关分析中，半数以上的指纹图谱共有峰峰面积为自变量，NO抑制率为因变量，共筛选出20个Pearson相关系数大于0.40的色谱峰。采用UPLC-QTOF-MS技术对S3批次吴茱萸药材提取液进行分析与成分指认，总离子流色谱图见图3，共鉴定并筛选出14个化学成分为潜在抗炎标志物见表4，进一步选择能获得对照品的化学成分（柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、奎宁酸、去氢吴茱萸碱、绿原酸、隐绿原酸、喹诺酮类生物碱等）进行体外抗炎活性验证，因谱效相关分析筛选出的喹诺酮类生物碱大部分无法获得，以同类型喹诺酮类生物碱二氢吴茱萸卡品碱为代表。

图3 正离子(A)与负离子(B)模式下的UPLC-QTOF-MS总离子流色谱图

表4 吴茱萸中的主要抗炎成分

“*”表示该化学成分有对照品

“*” means compound has a reference substance

2.7 吴茱萸潜在抗炎标志物的验证

2.7.1 细胞上清液中NO水平的测定 根据预实验，设置对照组、模型组、地塞米松（5 μmol/L）组、柠檬苦素（10、20、40 μmol/L）组、吴茱萸碱（1.25、2.50、5.00 μmol/L）组、吴茱萸次碱（20、40、80 μmol/L）组、奎宁酸（20、40、80 μmol/L）组、去氢吴茱萸碱（5、10、20 μmol/L）组、二氢吴茱萸卡品碱（5、10、20 μmol/L）组、绿原酸（0.25、0.50、1.00 mmol/L）组和隐绿原酸（0.25、0.50、1.00 mmol/L）组，按“2.5.2”项下方法处理细胞，按照试剂盒说明书测定细胞上清液中NO水平。结果如图4所示，与模型组比较，柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、奎宁酸、去氢吴茱萸碱、二氢吴茱萸卡品碱、绿原酸、隐绿原酸均可显著抑制细胞上清液中NO水平（＜0.05、0.01），呈剂量相关性。

2.7.2 细胞内iNOS水平的测定 RAW264.7细胞以8×105/mL接种于6孔板中，2 mL/孔，培养6 h。按“2.7.1”项下方法处理细胞，提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，按照试剂盒说明书测定细胞内iNOS水平。结果如图5所示，与模型组比较，柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、奎宁酸、去氢吴茱萸碱、二氢吴茱萸卡品碱、绿原酸、隐绿原酸均可显著抑制细胞内iNOS水平（＜0.01），呈剂量相关性。

2.8 统计学分析

3 讨论

本研究通过对吴茱萸药材指纹图谱和NO抑制率的谱效相关分析，确定24批吴茱萸药材指纹图谱中半数以上批次的共有峰与吴茱萸的抗炎活性有关，共挖掘出20个Pearson相关系数大于0.40的色谱峰；通过UPLC-QTOF-MS定性分析，共鉴定出14个化学成分，主要为柠檬苦素、奎宁酸类成分、绿原酸类成分、喹诺酮类生物碱等。NO由iNOS诱导催化产生，NO的累积会进一步加重炎症反应的发生。通过对柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、奎宁酸、去氢吴茱萸碱、二氢吴茱萸卡品碱、绿原酸、隐绿原酸的抗炎活性验证，发现以上8种化学成分均可显著抑制细胞上清液中NO和细胞内iNOS水平，与文献报道相符[13,23-26]。本研究基于谱效相关分析方法挖掘吴茱萸抗炎Q-Marker，发现除《中国药典》2020年版规定的柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱外，去氢吴茱萸碱和二氢吴茱萸卡品碱也具有较好的体外抗炎作用。课题组前期在吴茱萸体内抗炎研究中发现吲哚类生物碱、喹诺酮类生物碱和柠檬苦素具有良好抗炎作用[22]，与文献报道一致[27-28]。但本研究中抗炎指标较少，无法全面评价吴茱萸的抗炎作用，且对于含量差异小的成分不能通过谱效相关分析方法进行指认，因此，更多药效方面的吴茱萸Q-Marker的确认仍需要更深入的研究。

与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同

图5 吴茱萸中不同成分对RAW264.7细胞内iNOS水平的影响()

综上所述，本研究发现吴茱萸的抗炎作用来源于多种成分，并指认出柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、奎宁酸、去氢吴茱萸碱、二氢吴茱萸卡品碱、绿原酸、隐绿原酸为吴茱萸的抗炎Q-Marker，为中药药效结合成分的Q-Marker研究策略提供科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Study on anti-inflammatory quality markers ofbased on spectrum-efficacy correlation analysis

HUI Hui1, CHEN Qi-song2, TIAN Gang1, SHAN Qi-yuan1, QIN Lu-ping1

1. School of Medicine, Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 311402, China 2. Ningbo Yinzhou No.2 Hospital, Ningbo 315192,China

To explore quality markers (Q-Marker) of anti-inflammatory activity of Wuzhuyu () by spectrum efficacy correlation analysis and provide basis for the quality control of anti-inflammatory effect of.Fingerprints of 24 batches ofwere analyzed by ultra performance liquid chromatography (UPLC). LPS was used to induce RAW264.7 cells to establish aninflammatory cell model, the effect of 24 batches ofon nitric oxide (NO) levels in supernatant and intracellular inducible nitric oxide-synthase (iNOS) level were detected; SPSS software was used to correlate the relationship between fingerprint chromatographic peak area and anti-inflammatory drug efficacy. UPLC-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (QTOF-MS) was used to identify anti-inflammatory active ingredients of.NO inhibition rate of 24 batches ofextracts was 12% — 82%. A total of 14 potential anti-inflammatory components ofwere screened out by spectrum-efficacy correlation, including indolequinazoline alkaloids such as evodiamine, rutaecarpine, dehydroaevodiamine, quinic acid, chlorogenic acid, and quinolone alkaloids. Compared with model group, limonin, evodiamine, rutaecarpine, quinic acid, dehydroaevodiamine, dihydroevodiacarpine, chlorogenic acid, and neochlorogenic acid significantly inhibited NO level in supernatant and iNOS level of RAW264.7 cells (< 0.05, 0.01).Limonin, evodiamine, rutaecarpine, quinic acid, dehydroaevodiamine, dihydroevodiacarpine, chlorogenic acid, and neochlorogenic acid may be anti-inflammatory Q-Marker of.

quality marker;(Juss.) Benth.; ultra performance liquid chromatography; anti-inflammatory; spectrum-efficacy correlation analysis; limonin; evodiamine; rutaecarpine; quinic acid; dehydroaevodiamine; dihydroevodiacarpine; chlorogenic acid; neochlorogenic acid

R285.5

A

0253 - 2670(2021)09 - 2589 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.010

2021-03-05

国家自然科学基金青年基金资助项目（81703707）；浙江省中医药科技计划项目（2019ZA038）；宁波市鄞州区农业与社会发展科技项目（20191YZQ010017）

惠 慧（1995—），女，硕士研究生，研究方向为中药资源与品质评价。E-mail: hhui@zcmu.edu.cn

单琪媛，女，实验师。E-mail: shanqiyuan@zcmu.edu.cn

秦路平，男，博士生导师，教授。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

[责任编辑 李亚楠]