以药效成分群-活性-功效关联作用筛选当归质量标志物

刘妍如，唐志书*，宋忠兴，刘 峰，段金廒，陈 琳，史鑫波，杨宁娟，江大海

以药效成分群-活性-功效关联作用筛选当归质量标志物

刘妍如1，唐志书1*，宋忠兴1，刘 峰2，段金廒3*，陈 琳1，史鑫波1，杨宁娟1，江大海1

1. 陕西中医药大学 陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心，秦药特色资源研究开发国家重点实验室（培育），陕西省中药产业研究院，陕西 咸阳 712083 2. 陕西国际商贸学院，陕西步长制药有限公司，陕西 咸阳 712046 3. 南京中医药大学江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023

基于质量标志物（quality markers，Q-Marker）概念，通过构建当归的药效成分群-生物活性关联网络，确定影响当归药材质量的Q-Marker，建立当归药材的整体质控方法。以当归药材表征成分结合主成分分析结果，对15批次不同产地当归药材差异显著的活性成分进行筛选，将初步选定的差异成分作为当归质控的药效成分群。基于关联规则，建立体外、体内活性成分筛选评价模型，通过挖掘组分间关系，以此确定当归药材的Q-Marker，并建立了Q-Marker同时定量的测定方法。经UPLC-TOF/MS技术及药动学参数预测，找到当归中11个具有潜在药效活性的药效成分群。经药效成分群-生物活性关联网络分析，将阿魏酸、-藁本内酯和欧当归内酯A作为当归质控的Q-Marker，其方法学结果显示，3种化合物线性关系良好，＞0.990，精密度、重复性和稳定性良好，平均加样回收率范围为99.18%～100.25%。基于药效成分群-生物活性关联概念，采用多元统计结合液质联用分析技术的当归药材Q-Marker辨析方法，可以初步明确与当归药效紧密联系的化学成分来源，为当归的整体质量控制提供相关数据。

当归；质量标志物；药效成分群；活性；功效；阿魏酸；Z-藁本内酯；欧当归内酯A；关联网络；UPLC-TOF/MS

中药材是生产中药饮片和中成药的基本原料，其质量是保证中药饮片和中成药质量的关键和基础。因此，中药材质量的规范化是保证中药材质量的重要措施和重要前提。国务院于2016年发布了《关于促进医药产业健康发展的指导意见》，明确提出完善中药质量标准体系，提高中药质量标准的科学性和合理性。同年，刘昌孝院士[1]率先提出中药质量标志物（Q-Marker）的核心概念和理论，为提升我国中药产品质量和质量控制水平研究指明了方向[2-3]。基于中药整体质量控制的研究要求，本课题组认为，中药的整体质量不是单一成分药效的简单加合，而是存在着成分间多层次、多环节、多维度的非线性/线性协同作用。因此，要建立中药整体质量评价体系，首先要对影响中药质量的药效成分群-生物活性的互作因素及其功效相关的生物效应进行关联性分析，挖掘其内在的规律，对于找到关系药材整体质量的Q-Marker有重要涵义。这也是对于中药材、中成药整体质量提升与开发研究关键科学问题的初步认知。

当归为伞形科二年生草本植物当归(Oliv.) Diels的干燥根，其药用记载始见于《神农本草经》，距今已有2000多年历史。当归具有浓郁的香气，味甘、辛、微苦，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。临床主要用于治疗血虚萎黄、眩晕心悸、虚寒腹痛、风湿痹痛、跌扑损伤、肠燥便秘等症[4]。作为典型的生境主导型道地药材，产地生态环境是影响当归品质的主要因素，其道地主产区为甘肃南部，如岷县、宕昌等地区。其他产地如云南、四川、湖北等地也有少量分布。由于受到当归价格上涨等因素的影响，当归的种植规模在非传统产区有迅速扩张趋势。然而，由于药材生态环境的适宜性差异导致了各产区当归药材的质量参差不齐，也给当归质量控制带来很大困难[5-6]。目前对当归质量的控制主要参考《中国药典》2020年版，其中仅以阿魏酸作为单指标成分来评价当归质量，而川芎、藁本的指标性控制成分也是阿魏酸，因此单一成分并不能科学、全面、准确反映药材的内在质量[7-8]。针对目前当归质量参差不齐导致临床疗效不稳定的问题，本研究采用高分辨液质联用技术结合中药成分数据库对当归提取物的化学成分进行表征，以药动学参数（absorption-distribution-metabolism- excretion/toxicity，ADME/T）建议筛选标准对匹配化合物进行药效成分群筛选；选择当归的主要体外抗氧化指标和体内抗血虚、抗血瘀功效指标，通过建立体外和体内生物活性和主要成分的关联，找到与当归生物活性相关系数较高的成分，并将这些成分作为当归质控的Q-Marker。最后建立当归Q-Marker含量测定方法学，以此完成以成分映射药效的当归质量标志物的研究方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Acquity H-CLASS型超高效液相色谱（UPLC，美国沃特世科技有限公司）串联Triple TOFTM5600+质谱仪（美国爱博才思公司），液相配置：二元超高压溶剂系统、FTN自动进样管理器、PDA检测器和Empower3色谱工作站；Agilent 1290 Infinity II型超高效液相色谱（UHPLC，美国Agilent公司）串联AB Sciex 4500 Qtrap三重四级杆线性离子阱质谱仪（美国AB Sciex公司），液相配置：G7120A四元梯度泵、G7129B自动进样器、G7116A柱温箱；Sartorius CPA225D型十万分之一电子分析天平，德国赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器，江苏昆山市超声仪器有限公司；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅，上海科恒实业发展有限公司；GeneVac miVac低温离心浓缩仪，英国GeneVac公司；Thermo1510型全波长酶标仪、Thermo Micro17R微量低温冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司；FT-200动物跑步机，成都泰盟软件有限公司。

1.2 试剂

对照品阿魏酸，批号110773-201614，质量分数99.0%，中国食品药品检定研究院；对照品-蒿本内酯，批号wkq16052404，质量分数≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司；对照品欧当归内酯A，批号MUST-18032812，质量分数99.90%（HPLC），成都曼思特生物科技有限公司；GSH-PX试剂盒、羟自由基试剂盒，南京建成生物工程研究所；DPPH试剂，批号W27F10E81251，上海源叶生物科技有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS快速法），上海碧云天生物技术有限公司；肝素钠一次性使用真空采血管，江苏宇力医疗器械有限公司；盐酸肾上腺素注射液，远大医药（中国）有限公司，批号181201；甲酸（FlukaTM），色谱纯，美国霍尼韦尔公司；乙腈，色谱纯，德国默克公司；其他试剂均为分析纯。实验用水为屈臣氏蒸馏水。

1.3 药材

本研究所用各批次当归药材购于甘肃省，经陕西中医药大学刘世军教授鉴定为伞形科植物当归(Oliv.) Diels的干燥根。当归对照药材，批号120927-200613，购于中国药品生物制品检定研究院。15批当归药材及对照药材信息见表1。

1.4 动物

SPF级SD雄性大鼠，6～8周龄，体质量为 （200±20）g，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（川）2015-030。环境温度（23±2）℃，湿度（50±10）%，12 h光/暗循环（光照时间8:00～20:00），自由进食饮水。在实验开始前每天给予连续5 min的抚摸适应，1周后大鼠随机分组，每组6只。所有动物实验遵循陕西中医药大学实验动物伦理委员会有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R原则。

表1 15批当归信息

2 方法与结果

2.1 UPLC/Q-TOF-MS/MS成分表征及指纹图谱测定

2.1.1 色谱条件优化 流动相分别比较了乙腈-水和甲醇-水2个溶剂系统，结果表明，用乙腈-水二元梯度洗脱系统比用甲醇-水梯度洗脱基线平，且耗时短。分析时间仅用30 min，样品1 h谱图显示，30 min后无特征峰出现。

以相邻2峰的分辨率之和（∑s）、色谱分离系数（*）、色谱信息量（）和分层色谱响应值（hierarchical chromatographic response function，HCRF）对指纹图谱的分离峰个数（）、分离度和分析时间性能进行评价，色谱分离质量评价计算公式见式1～3[9]。

A为色谱峰面积，R为相邻两峰间分离度，n为理论塔板数

HCRF＝1 000 000＋10 000min＋max－min（3）

min为最小分离度，max－min为最大与最小保留时间之差

为了获得最佳的参数设置，选择柱温（25～35 ℃）、体积流量（0.2～0.5 mL/min）、缓冲液浓度（0.1%～0.2%甲酸水溶液、0.05%～0.2%乙酸水溶液）、水相初始比例（95%～99%），色谱柱类型［柱1（50 mm×2.1 mm，1.7 µm）；柱2（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）；柱3（100 mm×2.1 mm，2.5 µm）］作为优化参数，结果见表2。

优化结果显示，缓冲系统为0.1%甲酸水溶液，柱温为30 ℃时，水相初始比例为98%，体积流量为0.3 mL/min时，各峰分离度均＞1.5，理论塔板数参数优化结果较好，以各色谱峰计算均＞8000，因此将此作为固定条件进行样品测定。

表2 色谱条件优化结果

2.1.2 测定波长选择 检测波长经过对光电二级阵列管检测器检测三维图谱分析，根据当归药材中主要成分的特征波长，从波长210～400 nm选取代表各单味药材的重点波长323 nm，进行指纹图谱评价。

2.1.3 测定条件

（1）质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI），正离子模式下，采用信息依赖采集（IDA）、动态背景扣除（DBS）和高灵敏度模式采集数据。母离子（TOF-MS）扫描范围/50～1200，对超过100 cps的8个最强峰进行MS2采集数据，子离子（MS/MS）扫描范围为/50～1200。源喷射电压（ion spray voltage floating）为5500 V，裂解电压（declustering potential，DP）为40 V，碰撞能量（collision energy，CE）为10 eV，雾化气（ion source gas 1，GS1）和辅助气（ion source gas 2，GS2）为氮气，皆为344.738 kPa（50 psi），气帘气（curtain gas，CUR）241.316 kPa（35 psi），雾化温度（temperature，TEM）550 ℃。

（2）色谱条件：采用Acquity UPLC®BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱程序为0～1 min，2%乙腈；1～18 min，2%～100%乙腈；18～20 min，100%乙腈；20～23 min，100%～2%乙腈；23～25 min，2%乙腈；体积流量为0.3 mL/min；进样量2 μL；柱温30 ℃。

2.1.4 供试品溶液的制备 参照《中国药典》2020年版一部当归含量测定项下供试品溶液的制备方法，称取当归粉末（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入20 mL 70%甲醇，称定质量，85 ℃水浴回流30 min，静置放冷，称定质量，加入溶剂补足减少的质量，摇晃均匀后静置，取上清液滤过，精密量取续滤液1 mL，至10 mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，取续滤液，即为供试品溶液，备用。

2.1.5 对照品溶液的制备 参照《中国药典》2015年版一部当归含量测定项下对照品溶液的制备方法，取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成含阿魏酸12 µg/mL的对照品溶液，即得。

2.1.6 谱峰筛选 将UPLC/Q-TOF-MS/MS分析检测得到的图谱数据导入PeakView 2.2软件对化合物进行鉴定（图1-A）。通过对各样品正离子模式下UPLC/Q-TOF-MS/MS总离子流图比较、分析及筛选得到18个共有特征峰，其峰面积之和占总峰面积的90%以上（图1-B）。具有一定的代表性。根据PeakView 2.2软件、Masterview的中药成分数据库并结合一级质谱准分子离子峰、二级质谱碎片信息以及文献对18个化合物进行鉴定。根据PeakView 2.2软件分析其元素组成，并结合一级、二级质谱碎片信息以及文献，对当归指纹图谱中的共有峰进行鉴定，大致推断出18个化合物的可能结构信息 （表3）。

2.2 药效成分群筛选

本标准采用AB Sciex master view中药成分数据库（TCM Library 1.0）作为从指纹图谱共有峰中筛选药效成分群的匹配库，参考TCMSP数据库参数及SwissADME（http://www.swissadme.ch/）计算结果，对匹配化合物进行药动学参数预测筛选[19-20]。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%或类药性（drug-like，DL）≥0.18（TCMSP数据库），氢键给体＜5，氢键受体＜10，油水分配系数（Mlog）＜4.15（Swiss ADME预测）为关键筛选指标进行化合物筛选，得到11个化合物[21-22]。结果见表4。

2.3 体外抗氧化活性

2.3.1 样品溶液的制备 称取当归粉末（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入20 mL 70%甲醇，称定质量，85 ℃水浴回流30 min，静置放冷，称定质量，加入溶剂补足减少的质量，摇晃均匀后静置，取上清液滤过，取续滤液备用。

2.3.2 ABTS·+自由基抑制率测定 参照总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS快速法）检测方法，分别制备70%甲醇当归样本反应溶液（样本＋ABTS试剂）和70%甲醇阴性对照溶液（70%甲醇＋ABTS试剂）。按照说明分别配制工作液和反应液，加样在避光条件下进行，加样后27 ℃孵育6 min，使用酶标仪分别测定734 nm处吸光度（）值。每份样品平行测定3次，取平均值，按公式4计算ABTS·+自由基抑制率。结果显示，各批次样品ABTS·+自由基抑制率范围在81.42%～89.71%，大小分别为S14＞S7＞S4＞S8＞S3＞S10＞S12＞S2＞S15＞S9＞S5＞S11＞S6＞S13＞S1（图2）。

ABTS·+自由基抑制率＝(0－A)/0（4）

0为阴性对照溶液的值，A为当归样本反应溶液的值

2.3.3 DPPH·自由基抑制率测定 向0.2 mmol/L的DPPH·甲醇溶液加入等体积当归样本溶液（空白对照以70%甲醇溶液代替），加样后混匀，室温下避光静置30 min，用酶标仪测定517 nm处的值。每份样品平行测定3次，取平均值，按公式5计算DPPH·自由基抑制率。结果显示，各批次样品DPPH·自由基抑制率范围在42.89%～73.86%，大小分别为S14＞S13＞S2＞S9＞S5＞S3＞S1＞S4＞S7＞S6＞S8＞S11＞S15＞S12＞S10（图2）。

DPPH·自由基抑制率＝(s－b)/c（5）

s为150 μL的DPPH·溶液＋150 μL的当归样品值，b为150 μL的当归样品＋150 μL的70%甲醇溶液值，c为150 μL的70%甲醇溶液＋150 μL的DPPH·溶液值

2.3.4 羟基自由基（·OH）抑制率检测方法 将制备得到的当归样品溶液，使用低温离心浓缩仪挥干，蒸馏水溶解，备用。将·OH试剂盒中的试剂按照说明书方法分别配制测试溶液。经最佳取样浓度摸索后，优化结果在20%～55%时的稀释倍数为最佳稀释倍数，按1∶7稀释样品为最佳取样浓度，将各批次当归样品按照1∶7稀释后按操作表进行测试（稀释倍数为8）。按照实验操作表进行实验，用酶标仪测定550 nm处的值。每份样品平行测定3次，取平均值，按公式6计算·OH抑制率。结果显示，各批次样品·OH抑制率范围在61.36%～28.25%，大小分别为S6＞S4＞S3＞S5＞S1＞S2＞S14＞S7＞S8＞S9＞S12＞S11＞S15＞S13＞S10（图2）。

1-绿原酸 2-伞形花内酯 3-东莨菪内酯 4-阿魏酸 5-对香豆酸 6-洋川芎内酯I 7-滨蒿内酯 8-香豆素 9-肉桂酸 10-补骨脂素 11-佛手苷内酯 12-异茴芹内酯 13-洋川芎内酯A 14-蛇床子素 15--藁本内酯 16-欧当归内酯A 17-亚油酸 18-亚油酸甲酯

1-chlorogenic acid 2-umbelliferone 3-scopoletin 4-ferulic acid 5--coumaric acid 6-senkyunolide I 7-scoparone 8-coumarin 9-cinnamic acid 10-psoralen 11-bergapten 12-isopimpinellin 13-3--butyl-4,5-dihydrophthalide 14-osthole 15--ligustilide 16-levistilide A 17-linoleic acid 18-methyl linoleate

图1 当归药材UPLC/Q-TOF-MS离子流IDA提取谱图(A)及15批(S1～S15)不同产地当归药材UPLC指纹图谱(B)

Fig. 1 UPLC/Q-TOF-MS ion flow IDA extraction spectrum of ASR (A) and UPLC fingerprint chromatograms for 15 batches (S1—S15) of ASR from different habitats (B)

·OH−抑制率＝(对照－样本)/对照（6）

2.4 体内抗氧化研究

2.4.1 当归水提物制备[23]分别取各批次当归药材（S1～S15）2 kg，加10倍量蒸馏水浸泡4 h，然后以加热回流方式提取2次，每次2 h，滤过。药渣再以8倍量水进行加热回流提取2 h，滤过。合并水提液，真空减压浓缩干燥后得到当归水提物样品。

2.4.2 当归水提物对血虚（疲劳）大鼠作用研究

表3 15批当归药材共有峰鉴定

表4 当归化学成分筛选结果

（1）模型制备[24]：采用力竭跑步加负重游泳交替方法建立复合式疲劳大鼠模型。大鼠适应1周后，随机分为对照组、模型组和给药组，每组6只。参考前期研究，给药组于造模前1周开始给予当归水提物连续ig至实验结束，给药剂量为5 g/(kg·d)，模型组和对照组给予等体积生理盐水[23]。

负重游泳模型：将模型组和给药组大鼠置于底×高（0.5 m2×1.3 m）的圆形亚克力水缸中进行适应性游泳，适应期为1周，每次20 min，水温（25±2）℃。适应期后，按照每只大鼠体质量的5%计算游泳负重量，制备装有负重量钢球的负重物并束于大鼠尾根部，以大鼠沉入水底3 s即视作力竭。

图2 15批当归药材提取物体外抗氧化活性比较

疲劳式跑步模型：将模型组和给药组大鼠置于动物跑步机（六通道，通道末端加电刺激）进行适应性跑步训练，适应期为2 d，跑速为10 m/min，每次20 min，跑台坡度为0°。适应期后按坡度0°、10°、30°，跑速15、20、25 m/min程序，每15分钟逐步升级的方式进行45 min的疲劳式跑步，每天2次。跑步同时中以通道末端电刺激鼠尾部，以使大鼠保持持续性运动。

结果显示，与对照组比较，模型组大鼠血清GSH-Px活性显著降低（＜0.01）。与模型组相比，各给药组大鼠血清GSH-Px活性均显著升高（＜0.01）。除S1、S9、S11、S15批次药物与对照组相比无显著差异外，其他批次药物给药后血清GSH- Px活性均高于对照组（图3）。

2.4.3 当归水提物对急性血瘀大鼠作用研究

与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01

（1）模型制备[25-26]：参考前期研究，给药组于造模前1周给予当归水提物，ig剂量为5 g/(kg·d)，模型组和对照组给予等体积蒸馏水，共2周[23]。给药结束后，模型组和各给药组大鼠分别sc盐酸肾上腺素0.8 mL/kg，2 h后将大鼠浸入0～2 ℃冰水内游泳5 min，第1次给予盐酸肾上腺素后3 h，再次注射同等剂量的盐酸肾上腺素。对照组注射同等剂量的生理盐水，不进行冰水游泳。处置后，禁食不禁水。治疗结束后，大鼠眼眶采血0.5 mL，制备血清，检测各组GSH-Px活性。

2.5 当归Q-Marker筛选

将采集到的15批次当归水提物的UPLC-TOF- MS/MS成分鉴定数据、体外抗氧化活性、体内抗氧化活性数据导入Simca-p14.1软件进行特征峰评估以及偏最小二乘回归分析（partial least squares regression，PLS）计算。经标准化、对数转换及标度化预处理数据后，建立多元统计模型。选取前2个主成分拟合PLS模型。为了找到造成各组差异的成分信息，根据生成的PLS结果，绘制各成分关系的载荷图，提取组间差别较大的化合物信息进行鉴定（图4-A）。

同时，以变量投影重要性指标VIP（variable importance in projection）描述各化合物在系统分析的重要性，选定VIP大于1的化合物作为潜在的Q-Marker。结果得到具有较大载荷的化合物有3个，分别为欧当归内酯A（VIP：2.752），-藁本内酯（VIP：1.710）和阿魏酸（VIP：1.663）（图4-B）。进一步将各化合物与体外抗氧化活性、抗血虚疲劳GSH- Px活性、抗血瘀GSH-PX活性进行PLS关联性分析，其中阿魏酸、对香豆酸、蛇床子素、欧当归内酯A、-藁本内酯和亚油酸甲酯与体内外生物活性均呈正相关，且相关系数均大于0.6，说明上述化合物水平的高低对于当归的生物活性和疗效有重要影响（表5）。

图4 15批当归药材成分差异PLS载荷图(A)和VIP得分图(B)

因此，根据《中国药典》2020年版收载的药材质控标准，结合上述成分筛选结果，将欧当归内酯A、-藁本内酯和阿魏酸这3种化合物初步选定作为当归药材质控的Q-Marker。

2.6 当归Q-Marker测定方法学验证

2.6.1 供试品溶液的制备 见“2.1.4”项下方法。

2.6.2 混合对照品储备溶液的制备 取阿魏酸、欧当归内酯A和-藁本内酯对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成质量浓度分别为2.5、0.1、1.5 µg/mL的混合对照品储备溶液，即得。

2.6.3 测定条件

（1）定量质谱条件：定量质谱分析于采用ESI正离子模式进行扫描，检测模式为多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）。离子化参数为离子喷雾电压，正离子模式5500 V；TEM 550 ℃，GS1和GS2为氮气，皆为344.738 kPa（50 psi），CUR 241.316 kPa（35 psi）。化合物离子对优化采集参数：DP、CE和碰撞池出口电压（cell exit potential，CXP）等信息，如表6所示。

（2）液相条件：按“2.1.3（2）”液相色谱条件进行测定。

表5 当归药效成分群与体外、体内生物活性PLS关联分析

表6 阿魏酸、Z-藁本内酯、欧当归内酯A多反应检测参数

2.6.4 线性关系考察、检出限和定量限 精密吸取3种Q-Marker混合对照品储备溶液，按照优化的分析条件进行测定，按“2.1.3（2）”色谱条件进样，以峰面积为纵坐标（），进样溶液质量浓度为横坐标（）绘制标准工作曲线。得3种化合物线性范围为0.176～36.000 µg/mL，且和线性关系良好。

以阴性样品为检测对象，添加不同质量浓度的混合对照品溶液，按照信噪比（/）＞3计算检出限，按照/＞10计算定量限。本方法检出限在0.08～0.63 µg/mL，定量限在0.15～1.28 µg/mL。3种Q-Marker的线性方程、相关系数、方法检出限及定量限见表7。

表7 当归3个Q-Marker的线性方程、线性范围、r、检出限和定量限

2.6.5 专属性试验 按“2.1.3（2）”色谱条件，分别精密吸取空白对照溶液、混合对照品溶液、供试品溶液及空白对照样品溶液进样分析，结果见图5。结果表明3种活性成分之间互不干扰，理论塔板数以3种成分色谱峰计算均大于8000，符合定量要求，说明各成分专属性良好。

图5 混合对照品(A)、当归供试品(B)及阴性对照样品(C)溶液的UPLC-MS/MS提取离子流图

2.6.6 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.1.3（2）”项下色谱条件连续测定6次，记录峰面积。结果显示3个成分的保留时间RSD在0.01%～0.07%，峰面积RSD在0.78%～1.44%，结果表明仪器精密度良好。

2.6.7 重复性试验 取同一批供试品，按“2.1.4”方法制备6份供试品溶液，精密吸取各供试品溶液，按“2.1.3（2）”色谱条件进样测定，记录峰面积并计算质量分数。结果显示3个成分的保留时间RSD在0.07%～0.15%，峰面积RSD在0.19%～1.05%，结果表明该方法重复性良好。

2.6.8 稳定性试验 取“2.6.7”项下供试品溶液适量，分别于室温放置0、3、6、12、18、24、36、48 h，按“2.1.3（2）”色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示3个成分保留时间RSD在0.86%～1.49%，峰面积RSD在1.16%～1.49%，结果表明供试品溶液在室温放置48 h内基本稳定。

2.6.9 加样回收率试验 精密称取同一批已知含量的当归粉末0.2 g，平行称取6份，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，以药材中各成分与对照品含量1∶1比例加入已知质量浓度的混合对照品溶液，按“2.1.3（2）”色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。阿魏酸、-藁本内酯和欧当归内酯A的平均加样回收率分别为100.25%、99.18%、100.15%，RSD分别为0.32%、0.87%、1.23%。

2.6.10 各批样品测定 取15批当归药材样品，分别制备3份供试品溶液，精密吸取对照品溶液2 μL，供试品溶液2 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，按外标法计算各批样品中各成分的含量，结果见表8。

表8 15批当归药材中Z-藁本内酯、阿魏酸和欧当归内酯含量测定结果(, n = 3)

3 讨论

当归具有补血活血的重要功效，其药效与当归富含的酚酸类、香豆素类和多糖类成分有关。当归的活血功效主要表现在改善机体心血管能力如提高造血能力、抗血小板聚集、抗炎、抗氧化等方面；而其补血作用主要为能够缓解过度伤津耗液导致的心血不足，以提高机体抗氧化、抗疲劳能力[27]。因此，本研究将当过的体内外抗氧化活性作为评价当归功效高低的主要指标，建立体外和体内抗氧化评价模型，通过构建当归-体外/体内抗氧化活性-药效成分群的相关网络，对关键化合物进行评价，找出与质量、活性相关性最大的化合物，从而确定当归质控的Q-Marker。

本研究结果不但可以从药材源头实现对当归药材进行整体质量控制，完成当归药材的优选；同时，通对当归的药效基础的初步探索和研究，也可以明确与当归药效紧密的化学成分来源，为当归药材质量的稳定和有效控制提供科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 刘昌孝, 陈士林, 肖小河, 等. 中药质量标志物(Q-Marker): 中药产品质量控制的新概念[J]. 中草药, 2016, 47(9): 1443-1457.

[2] 刘昌孝. 中药质量标志物(Q-marker)：提高中药质量标准及质量控制理论和促进中药产业科学发展 [J]. 中草药, 2019, 50(19): 4517-4518.

[3] 张铁军, 白钢, 陈常青, 等. 基于“五原则”的复方中药质量标志物(Q-marker)研究路径 [J]. 中草药, 2018, 49(1): 1-13.

[4] 严辉, 段金廒, 尚尔鑫, 等. 当归不同部位入药功效取向差异的化学物质基础与药性关联性研究 [J]. 中草药, 2014, 45(21): 3208-3212.

[5] 严辉, 段金廒, 宋秉生, 等. 我国当归药材生产现状与分析 [J]. 中国现代中药, 2009, 11(4): 12-17.

[6] 严辉, 张小波, 朱寿东, 等. 当归药材生产区划研究 [J]. 中国中药杂志, 2016, 41(17): 3139-3147.

[7] 严辉, 段金廒, 钱大玮, 等. 我国不同产地当归药材质量的分析与评价 [J]. 中草药, 2009, 40(12): 1988-1992.

[8] 中国药典 [S]. 一部. 2020.

[9] Ji Y B, Xu Q S, Hu Y Z,. Development, optimization and validation of a fingerprint ofextracts by high-performance liquid chromatography [J]., 2005, 1066(1/2): 97-104.

[10] Zhou G S, Yang N Y, Tang Y P,. Chemical constituents from the aerial parts ofand their bioactivities [J]., 2012, 10(4): 295-298.

[11] 李丽丽. 基于植物的化学分类研究当归属植物的活性成分 [D].长沙:中南大学, 2010.

[12] Ma J P, Guo Z B, Jin L,. Phytochemical progress made in investigations of(Oliv.) Diels [J]., 2015, 13(4): 241-249.

[13] 闫忠红. 当归属药用植物的本草学、亲缘关系、化学成分及药理作用相关性研究[D].哈尔滨:黑龙江中医药大学, 2003.

[14] 张玉华. 当归和喜树CMCs体系对香豆素的生物转化初步研究 [D]. 广州: 广东药科大学, 2017.

[15] Tsuchida T, Kobayashi M, Kaneko K,. Studies on the constituents of Umbelliferae plants. XVI. Isolation and structures of three new ligustilide derivatives from[J]., 1987, 35(11): 4460-4464.

[16] Zhang H, Zhou D D, Yang F Q,. Modulation of electroosmotic flow in capillary electrophoresis by plant polyphenol-inspired gallic acid/polyethyleneimine coatings: Analysis of small molecules [J]., 2019, 1124: 7-16.

[17] Tang Y, Zhu M, Yu S,. Identification and comparative quantification of bio-active phthalides in essential oils from Si-Wu-Tang, Fo-Shou-San,and[J]., 2010, 15(1): 341-351.

[18] 林茂, 朱朝德, 孙庆民, 等. 当归化学成分的研究 [J]. 药学学报, 1979, 14(9): 529-534.

[19] Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules [J]., 2017, 7: 42717.

[20] Ru J, Li P, Wang J,. TCMSP: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines [J]., 2014, 6: 13.

[21] Lipinski C A, Lombardo F, Dominy B W,. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings [J]., 2001, 46(1/2/3): 3-26.

[22] Lipinski C A. Lead- and drug-like compounds: The rule-of-five revolution [J]., 2004, 1(4): 337-341.

[23] 李伟霞, 唐于平, 郭建明,等. 当归-川芎药对及其组成药味对3种血虚模型补血作用的比较研究 [J]. 中国中药杂志, 2011, 36(13): 1808-1814.

[24] 陈进成, 刘建勋, 林成仁, 等. 基于“劳则气耗”理论研究气虚证动物模型的建立方法 [J]. 中国中药杂志, 2018, 43(11): 2177-2183.

[25] 李伟霞, 王晓艳, 唐进法, 等. 基于PLS-DA和多指标综合指数法研究当归-川芎药对对急性血瘀大鼠血清中血管活性物质和黏附分子的影响 [J]. 药学学报, 2019, 54(11): 1909-1917.

[26] Shi X Q, Tang Y P, Zhu H X,. Pharmacokinetic comparison of seven major bio-active components in normal and blood deficiency rats after oral administration of Danggui Buxue decoction by UPLC-TQ/MS [J].,2014, 153(1): 169-177.

[27] Jin Y, Qu C, Tang Y P,Herb pairs containing(Danggui): A review of bio-active constituents and compatibility effects [J]., 2016, 181(1): 158-171.

Q-Marker screening method fordepending on effective components-bioactivity-efficacy network integration analysis

LIU Yan-ru1, TANG Zhi-shu1, SONG Zhong-xing1, LIU Feng2, DUAN Jin-ao3, CHEN Lin1, SHI Xin-bo1, YANG Ning-juan1, JIANG Da-hai1

1. Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, State Key Laboratory of Research and Development of Characteristic Resources of Qin Medicine, Shaanxi Institute of Traditional Chinese Medicine Industry, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712083, China 2. Shaanxi International Business College, Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co., Ltd., Xianyang 712046, China 3. Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization of Jiangsu Province, Jiangsu Key Laboratory for Traditional Chinese Medical Formula Research, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

According to quality markers (Q-Marker) theory, to establish a whole set of quality control methods forDanggui (, ASR) on the basis of effective components-bioactivity-efficacy network correlation analysis and determine Q-marker affecting the quality of ASR.Combined ASR components characterization with principal component analysis (PCA), the differential active components among 15 various habitats materials were directly evaluated, regarding the initially-selected components as the bio-efficacy components for quality control of ASR. Based on correlation analysis principle, the screening and evaluation models of active ingredientsandwere established by digging inter-relationship of components to determine the Q-marker of ASR. Meanwhile, the simultaneous determination methodology for the Q-Marker was established.With UPLC-TOF/MS technique and pharmacokinetic parameter prediction, 11 bio-efficacy components with potential drug effect activity were found. After being analyzed by the bio-efficacy components-bioactivity network integration analysis, ferulic acid,-ligustilide, and levistilide A were chosen as the Q-Marker for quality control of ASR. By using the established quantification method, the linearity coefficients of three Q-Marker were over 0.99. With a highly precision, repeatability and stability results, the average recoveries of three Q-Marker in the samples were ranged from 99.18% to 100.25%.Based on the concept of bio-efficacy components-bioactivity network correlation, UPLC-TOF/MS was used to discriminate the Q-Marker of ASR, in order to preliminarily identify the source of chemical constituents closely related to the efficacy of ASR, which can provide relevant statistics for the overall quality control of ASR.

; quality marker; bio-efficacy components; activity; efficacy; ferulic acid;-ligustilide; levistilide A; associated network; UPLC-TOF/MS

R283.6

A

0253 - 2670(2021)09 - 2626 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.014

2021-02-04

国家重大科技专项“重大新药创制”项目（2019ZX09301-133）；陕西省科技厅重点产业创新链（群）项目（2020ZDLSF05-08）；陕西省“特支计划”青年拔尖人才项目（陕组通字【2018】33号）

刘妍如（1985—），女，副教授，硕士生导师，研究方向为中药质量控制研究。Tel: (029)38182201 Email: yanzi_2203@aliyun.com

唐志书（1972—），教授，硕士生导师，主要从事中药制剂制备技术的研究。Tel: (029)38185060 Email: tzs6565@163.com

段金廒（1956—），教授，博士生导师，中国自然资源学会中药及天然药物资源专业委员会主任委员，国家“973”计划首席科学家。Tel/Fax: (025)85811116 E-mail: dja@njutcm.edu.cn

[责任编辑 郑礼胜]