广藿香UPLC指纹图谱研究及基于网络药理学的广藿香潜在质量标志物预测

李 媚，陈盛君*，王协和，李玲玲，徐以亮，狄留庆, 5

广藿香UPLC指纹图谱研究及基于网络药理学的广藿香潜在质量标志物预测

李 媚1, 2, 3, 4，陈盛君1, 2, 3, 4*，王协和2, 3, 4，李玲玲1, 2, 3, 4，徐以亮2, 3, 4，狄留庆1, 5

1. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210000 2. 江阴天江药业有限公司，江苏 江阴 214434 3. 江苏省中药配方颗粒制备与质量控制关键技术重点实验室，江苏 江阴 214434 4. 江苏省中药配方颗粒工程技术研究中心，江苏 江阴 214434 5. 江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心，江苏 南京 210000

基于UPLC指纹图谱、质量标志物“五原则”和网络药理学，研究道地产区不同产地广藿香药材，预测广藿香治疗病毒感染和胃溃疡的潜在质量标志物。建立广藿香UPLC指纹图谱，利用SIMCA-P 14.1分析软件对14批药材共有峰进行聚类分析，利用偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）筛选共有峰组间主要差异成分。基于质量标志物“五原则”，对差异成分进行初步分析，进一步采用网络药理学，通过相应数据库检索差异成分、病毒感染和胃溃疡疾病靶点。采用David 6.8数据库对共有靶点进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，同时构建“成分-靶点-疾病-通路”网络，分析广藿香主要活性成分和关键靶点。UPLC指纹图谱研究结合聚类分析结果显示，广东省2个产地广藿香药材存在一定差异。经PLS-DA分析，筛选出4个差异成分，依次为毛蕊花糖苷、广藿香酮、紫葳新苷和列当苷。根据质量标志物“五原则”结合网络药理学分析结果，预测广藿香主要活性成分为广藿香酮和毛蕊花糖苷，两者主要通过作用于ERBB2、EGFR、TLR4、AKT1、TNF靶点，调控TLR、ErbB、MAPK等信号通路，发挥抗病毒、调节肠胃功能等作用。建立的UPLC指纹图谱方法简便，筛选的2个活性成分毛蕊花糖苷和广藿香酮可作为广藿香潜在的质量标志物，为广藿香药材质量的控制和药效相关机制的研究提供参考。

广藿香；指纹图谱；聚类分析；质量标志物“五原则”；网络药理学；毛蕊花糖苷；广藿香酮；紫葳新苷；列当苷；UPLC；PLS-DA

广藿香药材为唇形科植物广藿香(Blanco) Benth.的干燥地上部分，具有芳香化浊、和中止呕、发表解暑的功效[1]。现代药理研究表明，广藿香具有抗细菌、真菌、疟原虫[2-7]及调节胃肠功能、促进消化液分泌、保护胃肠屏障[8-11]、免疫调节[12-13]、止吐[14]、抗炎[12,15]、抗氧化[16-18]、抗癌、抗肿瘤[19-20]、抗病毒[21-22]、杀虫[23-26]、抗锥虫[27]等药理活性。

刘孝昌院士[28]提出的中药质量标志物（quality markers，Q-Marker）概念，是基于药物成分的质量传递与溯源、特有性、有效性、处方配伍的环境和成分可测性“五原则”进行的研究，体现了以Q-Marker为基础的中药材、饮片、单方或复方制剂全程质量管理体系，在中药的质量控制研究中发挥着重要作用[29]。网络药理学作为一种建立在系统生物学和网络生物学基础上的新兴研究方法，具有系统性和整体性的特点，广泛用于单味药及复方药治疗疾病多靶点作用机制的预测与研究[30-31]，同时作为一种辅助分析方法，对于挖掘中药材、饮片和复方Q-Marker发挥着重要的作用[32-36]。

广藿香化学成分包括黄酮类、萜类、苯乙醇苷类和甾体等。其中，广藿香酮和广藿香醇属于萜类，毛蕊花糖苷、列当苷等属于苯丙乙醇苷类[37-40]。目前，有关广藿香发挥药理作用的活性成分研究最多的是广藿香醇，对其他潜在的活性成分尚不清楚。道地药材具有品种优良、疗效突出的特点，本研究以道地产区广东产广藿香为例，建立广藿香药材指纹图谱，通过偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）分析对共有峰进行初步筛选，选择主要差异成分，根据Q-Marker“五原则”结合网络药理学，基于广藿香功能主治，预测广藿香治疗病毒感染和胃溃疡的主要活性成分和关键靶点及作用机制，为广藿香质量控制和临床发挥疗效的机制研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器与试药

赛默飞Vanquish Core超高效液相色谱仪，赛默飞公司；安捷伦1290型超高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；安捷伦6530四级杆串联飞行时间质谱仪，电喷雾离子源（ESI）；MassHunter Data Acquisition采集工作站，MassHunter Qualiative Analysis分析工作站，美国安捷伦公司；Mettler Toledo ME204型万分之一电子分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ-250DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；QWJ-125D型往复式切药机，江阴香山中药机械有限公司；控温水浴锅，南通华泰实验仪器有限公司；SHZ-DIII循环水真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；BPG- 9156A精密鼓风干燥箱，上海恒科学仪器有限公司。

乙腈为色谱纯，Thermo Fisher公司；水为超纯水；甲酸、磷酸、冰醋酸，色谱纯，Aladdin公司；其他试剂均为分析纯。

对照品广藿香酮（质量分数为100.00%，批号111822-201102）、毛蕊花糖苷（质量分数为92.50%，批号111530-201713），以上对照品均购自中国食品药品检定研究院；对照品异毛蕊花糖苷（质量分数为98.00%，批号ST00490120MG）、芹菜素-7--β--葡萄糖醛酸苷（质量分数为98.00%，批号ST08920120），以上对照品均购自诗丹德生物技术有限公司。

1.2 药材

14批广藿香药材经江阴天江药业有限公司药材鉴定高级工程师唐波鉴定均为唇形科植物广藿香(Blancome) Benth.的干燥地上部分。14批广藿香药材具体产地信息见表1。

2 方法与结果

2.1 UPLC-Q-TOF/MS检测

2.1.1 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；干燥气温度300 ℃，体积流量8 mL/min，雾化压力241.316 kPa（35 psi）；负离子模式下毛细管电压3500 V，正离子模式下毛细管电压4000 V；高分辨模式数据采集，采集范围/100～2000。

表1 广藿香药材信息

2.1.2 色谱条件 Acquity UPLC®BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～2 min，10%～22%甲醇；2～15 min，22%～49%甲醇；15～25 min，49%～75%甲醇；检测波长为310 nm；柱温为30 ℃；体积流量为0.3 mL/min。

2.1.3 供试品溶液制备 取广藿香样品粉末（编号S1）约0.5 g，精密称定，分别加入50%甲醇溶液25 mL，回流提取30 min，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.4 广藿香药材正离子基峰离子色谱图 取供试品溶液，按照“2.1.1”和“2.1.2”项的色谱和质谱条件，分析出广藿香药材UPLC-Q-TOF/MS的正离子基峰离子色谱图，见图1。

根据质谱数据结合参考文献和化学数据库对其物质基础进行快速鉴定，推测广藿香中化合物分子式，共鉴定了其中16个峰可能代表的化学成分，鉴定结果见表2。

利用对照品对质谱初步鉴定结果进行了指认，指认了毛蕊花糖苷（峰7）、异毛蕊花糖苷（峰9）、芹菜素葡萄糖醛酸苷（峰10）和广藿香酮（峰13），指认结果见图2。

2.2 指纹图谱分析

2.2.1 精密度试验 取广藿香样品粉末（S1）约0.5 g，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.2”项下色谱条件连续进样6针，将所得图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件（2012版），计算各样品UPLC图谱的相似度。结果各特征峰相对保留时间的RSD均＜0.06%，相对峰面积的RSD均＜0.5%，指纹图谱的相似度均＞0.995。表明仪器精密度良好。

2.2.2 重复性试验 取广藿香样品粉末（S1）约0.5 g，按照“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1.2”项下色谱条件测定，将所得图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件（2012版），计算各样品UPLC图谱的相似度。结果各特征峰相对保留时间的RSD均＜0.15%，相对峰面积的RSD均＜2.0%，指纹图谱的相似度均≥0.995。表明该方法重复性良好。

图1 广藿香药材UPLC-Q-TOF/MS正离子基峰离子色谱图

表2 广藿香UPLC-Q-TOF/MS鉴定结果

图2 对照品指认结果

2.2.3 稳定性试验 取广藿香供试品溶液（S1），按照“2.1.2”项下色谱条件分别在制备后0、1、2、4、6、8、10、12 h进样测定，将所得图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件（2012版），计算各样品UPLC图谱的相似度。结果各特征峰相对保留时间的RSD均＜0.2%，相对峰面积的RSD均＜0.7%，指纹图谱的相似度均≥0.995。表明该供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.4 指纹图谱建立 按“2.1.3”项下方法分别制备14批广藿香药材供试品溶液，按照“2.1.2”项下色谱条件测定，记录UPLC图。将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件（2012版），得到13个共有峰，以S1为参照图谱，采用中位数法，时间窗为0.1 s，进行多点校正和全谱峰匹配，生成对照指纹图谱（R），见图3。以对照指纹图谱为参照，计算共有峰相似度，结果显示，S1～S5、S11～S14相似度均在0.941～0.993，相似度较高，S6～S10相似度在0.760～0.850，相似度较低。结果见表3。

2.2.5 聚类分析 将14批广藿香的13个共有峰相对峰面积导入SIMCA-P 14.1分析软件，对样本进行聚类分析，分析结果见图4。结果显示，广藿香药材S1～S5、S11～S14聚为1类，S6～S10聚为1类，说明广东省2个产地广藿香药材之间存在一定差异。

图3 广藿香药材指纹图谱

表3 广藿香药材相似度结果

2.2.6 PLS-DA分析 采用PLS-DA分析方法对13个共有峰分别进行分析，得分图、S-plot分析结果和变量重要性投影预测结果分别见图5～7。得分图结果显示，广东省2个产地广藿香各自聚为一类，2个产地药材之间存在差异。S-plot图中距离原点由远到近的4个变量依次为峰7、13、6、8，变量距离原点中心越远，对样品的区分能力越强。VIP图中，一般VIP值＞1的变量为组间样本的主要差异变量，且VIP值越大，表明该成分对组间差异的贡献越大。综合图6、7，得出各色谱峰影响程度前4位依次为峰7＞峰13＞峰6＞峰8，根据质谱鉴定及对照品指认结果，峰7为毛蕊花糖苷，峰13为广藿香酮，峰6可能为紫葳新苷，峰8可能为列当苷。即广藿香主要差异成分为毛蕊花糖苷、广藿香酮、紫葳新苷和列当苷。

图4 广藿香药材聚类分析

图5 广藿香PLS-DA得分图

图6 广藿香PLS-DA S-plot图

图7 广藿香PLS-DA VIP值图

3 基于“五原则”的广藿香Q-Marker探讨

3.1 基于植物亲缘学及化学成分特有性探讨广藿香Q-Marker

广藿香始载于《异物志》，根据产地不同，石牌、宝岗等地产广藿香又称“牌香”；肇庆地区高要等地产广藿香又称“高要藿香”“肇香”。广藿香醇和广藿香酮为广藿香特有性成分，不同品种和遗传多样性都会影响两者的含量，刘晓莹等[42]采用AFLP反应体系对14个不同种群的212个样本进行遗传多样性分析，研究广藿香遗传变异和遗传结构，发现广藿香的种间遗传多样性高于种内遗传多样性，且种群间遗传分化远大于种群内遗传分化。谢宜杰等[43]采用甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技术对广藿香酮和广藿香醇的基因组DNA进行甲基化分析，结果石牌广藿香（酮型）与其余产地的广藿香（醇型）分成2个分支，广藿香居群间的变异所占百分比远大于居群内变异所占百分比。对筛选出的10条石牌产地与其余产地差异性片段进行预测分析，发现一条属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，说明可通过MSAP技术在不同来源的样品中鉴别出石牌产地的广藿香，广藿香不同化学型的形成与其DNA甲基化水平有密切连续。

3.2 基于传统药效与药性探讨广藿香Q-Marker

3.2.1 成分与传统功效的相关性 《中国药典》2020年版中记载广藿香具有芳香化浊、和中止呕、发表解暑的功效。《名医别录》中曰“疗风水毒肿，去恶气，疗霍乱、心痛”，《本草逢原》中“藿香入手足太阴。芳香之气主脾醒胃，故能止呕逆，开胃进食。温中通。凡时行疫疠，山岚瘴疟，用此醒脾健胃，则邪气自无容而愈矣”。广藿香酮为广藿香挥发油的主要成分之一，毛蕊花糖苷、紫葳新苷、列当苷为苯乙醇苷类主要成分。现代药理学研究表明广藿香挥发油、苯乙醇苷类具有调节脾胃、抗病毒等药理作用[44-46]，与广藿香传统药效具有一定的相关性。

3.2.2 成分与药性的相关性 广藿香味辛，微温。归脾、胃、肺经。辛味药主要包含挥发油类、苷类和生物碱类3类化学成分，其中挥发油、苷类是辛味药的物质基础[47]。研究表明，辛味药具有发散解表的作用，主要表现在解热、抗菌、抗病毒、调节脾胃等方面。故广藿香酮、毛蕊花糖苷和列当苷等可作为Q-Marker分析对象。

3.3 基于入血成分探讨广藿香Q-Marker

药物经吸收入血后才能发挥药效，所以，分析给药入血后的中药成分及其体内代谢产物对中药Q-Marker的预测分析具有重要意义。黎玉翠[15]建立LC-ESI-MS分析方法，大鼠口服给药广藿香酮，考察了广藿香酮在大鼠体内的代谢行为，发现口服后大鼠血液、胆汁和尿液中均可检测到广藿香酮及其代谢产物，而在粪便中未检测到广藿香酮原型及其代谢物，说明大鼠口服广藿香酮后，存在肝肠循环，对广藿香酮给药后不同时间广藿香酮体内代谢产物进行检测，结果发现广藿香酮给药后5 min开始，即可检测到代谢产物。前期研究发现，大鼠口服给药广藿香酮2 h内血液浓度即可达到峰值，其半衰期低于5 h[48]，给药24 h后血液中仅能检测到极微量的广藿香酮。秦臻[49]建立的广藿香药材及血浆中广藿香酮定量分析方法简便快捷，可作为广藿香药材及其相关制剂中广藿香酮的含量测定及质量控制监控的手段，适用于广藿香酮在生物体内含量的测定。且对广藿香酮体内生物利用度进行了研究，经测定血浆中广藿香酮含量，发现小鼠口服广藿香酮后，体内过程均表现为峰浓度与血药浓度-曲线下面积与给药剂量均呈正比，符合线性剂量关系，广藿香酮在小鼠体内绝对生物利用度为76.67%，提示广藿香酮在小鼠体内吸收度良好。霍仕霞等[50]通过大鼠ig给予不同剂量毛蕊花糖苷，采用LC-MS/MS法测定不同时间点大鼠血浆及组织中毛蕊花糖苷浓度，发现毛蕊花糖苷在大鼠体内的吸收属于一级动力学，其中分布在小肠和肺浓度最高，其次为胃和肌肉，且通过尿液、粪便和胆汁排泄量较少，预测毛蕊花糖苷主要通过代谢过程吸收入血发挥作用。黄婧嫣[51]采用HPLC法检测大鼠一次大剂量ig给药毛蕊花糖苷后不同时间点血液和脏器中毛蕊花糖苷的含量变化，发现毛蕊花糖苷在胃肠道中的浓度最高，在其余脏器和血浆中分布较低。毛蕊花糖苷在胃肠道内发生了降解，主要产生了咖啡酸、羟基酪醇、咖啡酸、毛蕊花糖苷脱羟基酪醇产物和毛蕊花糖苷的同分异构体4种代谢产物，毛蕊花糖苷降解率为（26.68±1.38）%。

经TCMSP数据库（https://tcmspw.com/tcmsp. php）查询，广藿香酮、毛蕊花糖苷、列当苷和紫葳新苷的口服生物利用度依次为30.17%、2.94%、2.74%、3.28%；类药性依次为0.07、0.62、0.68、0.58。除广藿香酮外，毛蕊花糖苷、列当苷和紫葳新苷3种苯乙醇苷类成分口服生物利用度均较低。刘贵玉等[52]通过对部分苯乙醇苷类成分的体内药物代谢性质（absorption、distribution、metabolism、excretion，ADME）研究发现，苯乙醇苷类因其特殊的结果，在体内吸收较差，生物利用度低，但其药效显著，原型及其代谢产物组成的混合物是其发挥药效的活性成分，苯乙醇苷类成分口服进入人体后，在体内主要发生水解、还原、脱羟基、甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化等反应。研究发现，改善剂型可提高苯乙醇苷类成分的生物利用度，冯文彬 等[53]采用熔融法制备毛蕊花糖苷固体分散体，通过提高毛蕊花糖苷的溶出度，有效提高其生物利用度。Chen等[54]通过生物等位置换和功能“淘汰”战略设计了一种列当苷类似物来改善列当苷药动学特性和含量小等缺点，有效提高了其生物利用度。

3.4 基于成分可测性探讨广藿香Q-Marker

药典中只规定了广藿香中百秋李醇的含量测定方法及限度，对其他成分的含量测定方法目前也有相关研究，毕丹等[38]建立了UPLC色谱法同时测定广藿香中新西兰牡荆苷2、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、列当苷、藿香黄酮醇和广藿香酮含量，该方法稳定、简便可行，可用于广藿香质量控制。叶超等[55]采用HPLC法，以甲醇-0.1%醋酸水溶液（40∶60）为洗脱溶剂，建立了广藿香中毛蕊花糖苷的含量测定方法，该方法重复性好、简单可行，可作为广藿香药材质量标准控制方法。陈海明等[56]采用HPLC法，以乙腈-0.4%磷酸溶液（75∶25）为洗脱溶剂，建立了广藿香中广藿香酮的含量测定方法，该含量测定方法简便快捷，重复性好，可用于广藿香质量控制。

3.5 基于不同配伍中表达成分探讨广藿香Q-Marker

中药配伍后同一药味在不同复方中发挥的功效不同，化学成分也会发生变化，因根据不同处方中配伍情况分析其发挥作用的可能化合物。张睿增等[57]采用GC-MS分析技术分析广藿香和佩兰挥发性成分在配伍前后的含量及种类变化情况，发现药对中新增了蘑菇醇、金合欢烯、γ-广藿香烯等8个化合物，而广藿香中α-石竹烯、α-广藿香烯、广藿香烯等10个化合物和紫苏中紫苏醛、甲基丁香酚、异植物醇等9个化合物均在药对中未检测到。此外，单味药对中α-蒎烯、β-蒎烯、广藿香醇等化合物的含量在药对中明显提高，石竹烯、广藿香酮等化合物含量在药对中有所降低。唐飞等[58]采用GC-MS分析方法比较广藿香、厚朴配伍前后挥发油的化学成分及抗菌活性的影响，发现配伍后挥发油成分含量发生了变化，化合物新增了7种，减少了5种，广藿香醇含量较配伍前含量降低。且体外抑菌实验表明，配伍后抗菌活性增强，抗菌作用较单味药强。

综合以上，广藿香酮、毛蕊花糖苷、列当苷和紫葳新苷可作为广藿香质量标志物的研究目标，将进一步通过网络药理学预测其Q-Marker。

4 网络药理学分析

4.1 成分靶点预测分析

在Pubchem数据库（https://pubchem.Ncbi.Nlm. Nih.gov/）中查找广藿香酮、毛蕊花糖苷、列当苷和紫葳新苷4种差异性成分的Canonical SMILES编号并依次导入到Swiss Target Prediction数据库（http://www.Swisstargetprediction.ch/）中，选择物种为“homo sapiens”，预测各成分的靶点，剔除重复靶点蛋白，共得到相关的54个靶点蛋白。

4.2 疾病靶点预测

在数据库OMIM（http://www.omim.org/）、Gene Cards（https://www.genecards.org/）中分别以“Virus infection”和“Gastric ulcer”为关键词，其中GeneCards数据库中筛选出relevance score≥30的靶点，搜索相关疾病靶点，共得到与病毒感染和胃溃疡相关的疾病靶点分别为375、123。将广藿香4个成分靶点与2种疾病靶点进行匹配，运用Venny2.1.0工具绘制Venn图，见图8。结果广藿香4种成分与2种疾病共有5个共同靶点，分别为酪氨酸激酶受体2（erythroblastic oncogene B 2，ERBB2）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）、丝氨酸/酪氨酸激酶1（AKT1）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）。

4.3 功能富集分析与通路分析

利用David 6.8数据库（https://david.ncifcrf. gov/）对5个共有靶点进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。GO和KEGG分析均以＜0.05表示具有统计学意义。在GO富集分析中，共获取76个GO条目，其中生物过程（biological process，BP）占54个，分子功能（molecular function，MF）占14个，细胞组分（cellular component，CC）占8个；在KEGG通路富集中，共得到32条通路。选择＜0.05%且伪发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05%的GO条目和KEGG通路进行可视化分析，GO条目可视化结果见图9。GO分析结果提示生物过程（BP）主要富集在对细胞表面受体信号通路、蛋白质磷酸化、磷脂醇3-激酶信号、NO生物合成过程等的调节和细胞对表皮生长因子刺激的反应；分子功能（MF）主要富集在一氧化氮合成酶调节剂活性、受体信号蛋白酪氨酸激酶活性和蛋白激酶活性方面；细胞组分（CC）主要富集在等离子膜和细胞表面。KEGG通路可视化结果见图10。富集到的通路主要涉及Toll样受体（Toll-like receptor）信号通路、酪氨酸激酶（ErbB）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、子宫内膜癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、美国锥虫病、丙型肝炎、乙肝和甲型流感等。

图8 广藿香化学成分、病毒感染及胃溃疡疾病韦恩图

图9 共有靶点的GO分析

图10 共有靶点的KEGG分析

4.4 成分-靶点-疾病-通路网络构建

以54个靶点相关的4个成分、32条通路、2种疾病为节点（node），在Excel中建立彼此对应关系，将表格导入到Cytoscape 3.6.0软件中，建立成分-靶点-疾病-通路关系网络图，（正方形代表成分、菱形代表靶点、正六边形代表通路、锥形代表疾病），结果见图11。结果显示，广藿香酮（degree 35）和毛蕊花糖苷（degree 16）与各靶点连接度较高，说明广藿香酮和毛蕊花糖苷可能为广藿香主要活性成分。靶点ERBB2（degree 15）、EGFR（degree 20）、TLR4（degree 16）、AKT1（degree 28）、TNF（degree 22）与各通路连接度较高，同时与2种疾病有较高的连接度，说明ERBB2、EGFR、TLR4、AKT1、TNF为广藿香治疗病毒感染和胃溃疡的主要靶点。

图11 广藿香成分-靶点-疾病-通路关系网络图

5 讨论

经网络药理学分析，ERBB2、EGFR、TLR4、AKT1、TNF靶点是广藿香治疗病毒感染和胃溃疡的关键靶点，且5个关键靶点中AKT、TLR4、TNF参与TLR信号通路，ERBB2、EGFR参与ErbB信号通路。AKT1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2和AKT3）之一，调节许多过程，包括代谢、增殖、细胞生存、生长和血管生成。TLR4为跨膜蛋白，属于Toll样受体之一，TLR4的激活能导致细胞内信号通路核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和炎症细胞因子的产生，它的配体还包括几种病毒蛋白、多糖和多种内源性蛋白。TNF是一种由TNF基因编码的人类蛋白，主要由巨噬细胞分泌，可诱导某些肿瘤细胞系的细胞死亡，在一定程度下可刺激细胞增殖，诱导细胞分化。

TLR通路的信号传导主要与受体胞内TIR结构域和与之结合的接头蛋白髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）有关，经配体刺激后，MyD88使激酶白细胞介素受体相关激酶（interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK）结合到TLRs上，经过相互反应，白介素1受体关联激酶1重组蛋白（interleukin 1 receptor associated kinas 1，IRAK-1）被磷酸化而激活，然后导致c-Jun氨基末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JNK）和NF-κB的激活，对TLR通路进行负调节。

EGFR位于表皮，EGFR配体主要包括表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、转化生长因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）、BTC、肝素结合表皮生长因子（heparin binding epidermal growth factor，HBEGF）和EPR，其中EGF和TGF-α是最重要的2个配体，EGFR被配体激活后，诱导其内在蛋白激酶激活，并进一步激活下游细胞信号通路Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK、PI3K/PKB通路和JAK/STAT通路，在细胞增殖、存活、侵袭和转移过程中发挥着重要作用。ERBB2为酪氨酸蛋白激酶，GP30是该受体的潜在配体，调控外周微管的生长和稳定，ERBB2激活后，MEMO1-RHOA- DIAPH1信号通路发生磷酸化，从而抑制细胞膜上的糖原合酶激酶3Β（glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3B）。

ErbB信号通路通过介导PI3K/Akt通路、JAK/ STAT通路和MAPK信号通路来调控细胞增殖、迁移、分化、凋亡和细胞动性。在ErbB信号通路过程中，EGFR在与EGF或TGF-α结合后，通过系列蛋白相互作用，促进线粒体激活MAPK，从而激活PI3K/Akt通路、JNK和MAPK信号通路，进而触发基因转录，促进DNA合成和细胞增殖。

已有研究发现，广藿香中β-广藿香烯通过增强超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和氧化氢酶的含量，降低丙二醛含量抑制氧化应激，降低肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等的水平，以及下调Fas、FasL和半胱天冬酶-3（Caspase-3）蛋白表达，上调原癌基因蛋白（c-fos、c-jun）和微小RNA-21（microRNA- 21，miR-21）的基因表达和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）的磷酸化水平以抑制胃黏膜细胞凋亡，对抗无水乙醇引起的胃溃疡；还能通过降低TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、P-选择素（P-selectin）、血管细胞粘附分子（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等的水平，下调核因子Iκ抑制因子α（inhibitory subunit of nf kappa b alpha，IκBα）和JNK的磷酸化水平以抑制NF-κB与JNK信号通路，减缓炎症反应，升高环氧合酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的蛋白表达，促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和Fms样酪氨酸激酶-1（Fms-like tyrosine kinase-1，flt-1）表达，抑制内皮素-1（endothelin-1，ET-1）和内皮素A受体（endothelin A receptor，ETAR）表达以促进血管生成，加速吲哚美辛引起的胃溃疡愈合，还能降低TNF-α、细胞间黏附分子- 1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、P-selectin和MPO的水平，下调TLR4和MyD88的蛋白表达，抑制IκBα的磷酸化以及p65亚基的核易位，从而抑制TLR4介导的NF-κB信号通路，调节免疫功能以减缓肠黏膜的损伤[59]。

目前，有关广藿香抗病毒感染引起的相关疾病的治疗主要通过减轻病毒感染后的炎症反应来实现。研究发现，广藿香醇和广藿香酮均具有较强的抗炎活性，两者均可下调炎症介质的信使mRNA表达，依耐性地减少炎症部位TNF-α、IL-1β，PGE2和一氧化氮的堆积，抑制炎症部位TNF-α、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、诱导型一氧化氮合酶和COX-2和PGE2的合成，减少炎症组织中丙二醛堆积，降低NO含量来发挥抗炎活性[60-61]。Mirko等[62]发现毛蕊花糖苷通过抑制转化生长因子β激活激酶1/JNK/激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）及其下游COX-2和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达发挥抗炎作用。Motojima等[63]发现毛蕊花糖苷通过下调Ca/NFATc和JNK/MAPK信号通路，抑制IL-4、TNF-α等细胞因子的表达，抑制嗜碱性粒细胞I型超敏反应的发生。此外，毛蕊花糖苷还能抑制肥大细胞和嗜碱性细胞组胺、花生四烯酸和前列腺素的释放及细胞因子TNF-α、IL-4的产生，抑制炎症反应[64]。彭绍忠[65]研究发现，广藿香有效成分广藿香醇能降低致炎大鼠足趾中NO、PGE2、TNF-α含量，减轻炎症反应，延长病毒感染小鼠生存时间的作用，广藿香醇能增强肺组织中超氧化物歧化酶活力，降低丙二醛含量，减轻小鼠肺组织脂质过氧化损伤，提高抗自由基损伤功能，调节机体免疫功能，从而达到抗病毒作用。

本研究建立了广藿香药材UPLC指纹图谱，分析了不同产地广藿香药材的主要差异成分，基于质量标志物“五原则”，对差异成分进行了初步分析，发现差异成分符合“五原则”要求，可作为广藿香质量标志物的研究对象，进一步采用网络药理学，根据广藿香传统功能主治，对广藿香治疗病毒感染和胃溃疡的主要活性成分、关键基因和作用机制进行了分析，发现广藿香主要活性成分广藿香酮和毛蕊花糖苷主要通过作用于ERBB2、EGFR、TLR4、AKT1、TNF靶点，调控TLR信号通路、ErbB、MAPK等信号通路，发挥抗病毒、调节肠胃等作用。

本研究利用网络药理学对广藿香潜在Q- Marker进行预测分析时，首先对广藿香化学成分、疾病对应靶点进行匹配，选取广藿香化学成分与2种疾病共有靶点进行分析，筛选结果可信度较高，但考虑到目前网络药理学研究仍然具有一定的局限性，同一成分在不同药物或不同处方中，筛选结果相似度程度高，后续仍需通过药效实验进行验证，以进一步确定本研究预测结果的准确性。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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UPLC fingerprint ofand prediction of its potential quality markers based on network pharmacology

LI Mei1, 2, 3, 4, CHEN Sheng-jun1, 2, 3, 4, WANG Xie-he2, 3, 4, LI Ling-ling1, 2, 3, 4, XU Yi-liang2, 3, 4, DI Liu-qing1, 5

1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China 2. Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co., Ltd., Jiangyin 214434, China 3. Jiangsu Key Technology Laboratory for Preparation and Quality Control of Traditional Chinese Medicine Granules, Jiangyin 214434, China 4. Jiangsu Traditional Chinese Medicine Formula Granule Engineering Research Center, Jiangyin 214434, China 5. Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of TCM, Nanjing 210000, China

To research Guanghuoxiang (, PH) in different producing areas and predict the main active ingredients of PH in the treatment of viral infection and gastric ulcer based on UPLC fingerprint, “five principles” of quality markers and network pharmacology.The UPLC fingerprint of PH was established, and the common peaks of 14 batches were analyzed by SIMCA-P 14.1 analysis software, and the main difference components were selected by partial least squares- discrimination analysis (PLS-DA). Based on quality markers “five principles”, the differential components were preliminarily analyzed; The differential compositions, virus infection and gastric ulcer disease related targets were retrieved through the related database by network pharmacology. David 6.8 database was used for gene ontology (GO) function enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of common targets, and a “component-target-disease- pathway” network was constructed to analyze the main active components and key targets of PH.The results of UPLC fingerprint and cluster analysis showed that there were some differences in PH between the two producing areas in Guangdong Province. Four different components were selected by PLS-DA, which were verbascoside, pogostone, campneoside I and crenatoside in order. According to the “five principles” of quality markers combined with the network pharmacological analysis results, the main active ingredients of PH were pogostone and verbascoside. Both of them could regulate TLR signaling pathway, ErbB, MAPK and other signaling pathways by ERBB2, EGFR, TLR4, AKT1 and TNF targets, and played antiviral and gastrointestinal regulation roles.The UPLC fingerprint method established in this study was simple, the two active ingredients could be used asquality markers of PH, which provided reference for the research on quality control of PH and the mechanism related to drug efficacy.

; fingerprint; cluster analysis; “five principles” of quality markers; network pharmacology; verbascoside; pogostone; campneoside Ⅰ; crenatoside; UPLC; PLS-DA

R283.6

A

0253 - 2670(2021)09 - 2665 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.017

2021-02-04

国家科技重大专项项目（2019ZX09201005-002-006）

李 媚（1994—），女，硕士研究生，研究方向为中药复方与经典名方研究开发。Tel: 19852880756 E-mail: 202918054@qq.com

陈盛君（1979—），女，博士，副主任药师，硕士生导师，从事中药配方颗粒与经典名方研究开发工作。Tel: 15370230291 E-mail: chensj@tianjiang.com

[责任编辑 郑礼胜]