有氧训练干预对大鼠小脑神经细胞黏附分子表达和学习记忆的影响

2021-05-10卢晓斌张业廷张树玲袁琼嘉

南京体育学院学报 2021年3期

卢杰，李雪，王璐，范佳，卢晓斌，张业廷，张树玲，袁琼嘉

（1.成都体育学院运动医学与健康学院，四川成都610041；2.苏州市体育科学研究所，江苏苏州215131；3.四川农业大学体育学院，四川雅安625014）

空间学习和记忆是指动物通过编码环境信息来促进空间导航，是回忆关联刺激位置的一个过程［1］，主要依赖海马和内嗅皮质周围区的完整性［2］。不过有研究表明，小脑除了维持运动姿势平衡和运动学习以外［3］，还参与空间学习和记忆［4］。基因敲除技术进一步揭示，小鼠小脑蒲肯野细胞损伤后，其空间学习和记忆能力出现障碍［5］。学习和记忆可引起突触的网络结构发生变化，其结构可塑性主要表现为突触的增长和缺失［6］。研究发现，神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）属于免疫球蛋白超家族中的一种细胞表面大分子，它对学习记忆的形成和神经突触可塑性具有重要的影响［7］。有研究证明，NCAM基因敲除后，小鼠表现出空间学习障碍［8］；对大鼠进行水迷宫模拟训练后，大鼠NCAM的表达量在可塑性脑区出现上调，其空间学习记忆能力稳步提高［9］。

有氧运动可改善和增强人的认知能力［10］，规律合理的运动甚至可以减轻脑损伤，促进脑的空间学习记忆能力［11］。在基础研究方面，多数研究关注运动对大鼠海马NCAM表达的影响，长期中等和大负荷运动可以提高大鼠海马NCAM表达［12-13］，但有氧训练调控大鼠小脑NCAM表达并不明确。因此，本研究通过对大鼠进行8周不同负荷游泳运动干预，观察运动建模后小脑NCAM的变化情况，分析不同负荷运动对大鼠学习和记忆能力的影响，探索有氧训练影响大鼠小脑学习和记忆能力的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

购进30只（SPF）级Sprague Dawley（SD）大鼠（成都达硕公司），2月龄雄性，体重（298±19）g，许可证号：CSXK（川）2008-24，本实验通过成都体育学院动物伦理委员会批准。将大鼠放置在本院动物实验房，室温为（26±3）℃。分笼饲养，3～4只/笼，按国家标准啮齿类动物饲料喂养原则进行饲养，正常饮水，自由摄食，自然光照并保持通风，确保动物实验室清洁卫生。

1.1.2 仪器和试剂

Morris水迷宫装置与测试系统购自北京智鼠多宝生物科技有限责任公司，恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司，电泳仪购自美国Bio-Rad公司，分光光度计购自美国Thermo Fisher公司，实时荧光定量PCR检测仪购自美国Bio-Rad公司。大鼠睾酮ELISA实验试剂盒购自美国R&D Systems公司，NCAM1小鼠单克隆抗体购自美国OriGene公司，苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）蛋白酶抑制剂、RIPA裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂购自上海碧云天生物技术有限公司，蛋白质分子量Marker购自美国Thermo Fisher公司，焦碳酸二乙酯购自上海一研生物科技有限公司，RNA提取液购自美国GeneCopoeiaTM公司，SYBR Green实时荧光定量PCR混合液购自美国Thermo Fisher公司，NCAM引物、β-actin引物均由大连宝生物工程有限公司设计。

1.2 方法

1.2.1 实验分组和干预方法

首先对大鼠进行适应性喂养，共3 d，接着进行1 d的定位航行实验。然后把大鼠随机分为正常组（control，n=10）、中等负荷运动组（moderate-load training，MT，n=10）和高度负荷运动组（high-load training，HT，n=10）。正常组无运动干预、正常进食，高度负荷运动组和中等负荷运动组分别进行游泳训练干预。游泳装置为玻璃缸（150 cm×60 cm×100 cm），水温（34±2）℃，水深80 cm。大鼠具体的游泳运动建模方案：中等负荷运动组（6 d/周+1次/d+第1 d下水游10 min+每天累加5 min+第1周末训练30 min+第2周末训练60 min+第3周至第8周60 min/d）；高度负荷运动组（6 d/周+1次/d+第1 d下水游10 min+每天累加5 min+第2周末训练60 min+第3周末训练120 min+第4周至第8周120 min/d+第4周大鼠斜挎附加自身体重1%含有螺帽的尼龙绳训练+之后附加重量每周递增1%至第8周大鼠负自身体重5%）。

1.2.2 Morris水迷宫

本研究选用Morris水迷宫系统评测大鼠空间学习与记忆能力［14］。Morris水迷宫池呈圆柱状，人为地将圆形池划分为4个象限，在第4象限中心处设置一个站台，直径为12 cm，低于水面2 cm，池水用碳素墨水染黑。水迷宫边缘用帘子遮挡，设置线索提示，环境光线均匀且暗淡。定位航行实验持续1周，大鼠自由游泳，直到在120 s内找到第4象限的圆形平台，准许大鼠在圆台上歇息10 s，系统会记录大鼠从入水至探寻到圆形支撑台所用的时间；如果在120 s内没有探索到圆台，科研人员应将大鼠导引至圆形平台，歇息10 s，实验结束，大鼠的潜伏耗时计为120 s。水池的上方有摄影机全程采集大鼠的活动影像，电脑系统则可追踪大鼠的游泳轨迹等数据。随后将支撑台拆除，入水点设置在第2象限，大鼠依次进行1 d的空间探索实验。参考线索提示，大鼠凭记忆去探寻原支撑平台，电脑系统软件则可计算60 s内大鼠穿越原支撑台所处位置次数。

1.2.3 血液收集和小脑组织样本采集

Morris水迷宫实验结束后，将大鼠断头，取血于EP管中，室温静置1 h后离心，分别取出血清，将其放置到-20℃冰箱保存。大鼠断头取血后，开始进行小脑组织样本采集。齐耳缝剥出大鼠的脑组织在冰生理盐水中漂洗，用滤纸拭干，将脑组织迅速转移到锡箔纸上再分离小脑，装进冻存管，并置于液氮内低温冻存。

1.2.4 ELISA

按照实验试剂盒说明书的要求，准备试剂，溶解或稀释显色剂（substrate solution）、清洗液（wash buffer）、睾酮标准品（testosterone standard），向96孔板子中加入抗体原溶液（primary antibody solution）、每个孔均50μl，将板子置于摇床上、摇匀1 h、最高转速（500±50）r/min，洗涤4次，添加标准品并加样，添加睾酮结合物（testosterone conjugate）、每孔50μl，保温混匀，洗涤4次，然后加入substrate solution显色、30 min，添加50μl stop solution至每孔、可以观察到由蓝色变为黄色，30 min之内进行比色、测出OD值。用Excel软件绘制标准曲线，x轴表示标准值浓度，y轴代表标准值的OD值，最后计算出样本的浓度。

1.2.5 real time RT-PCR

按照RNAzol试剂盒（GeneCopoeiaTM公司）说明书，提取小脑总的RNA，分光光度计检测RNA的纯度、浓度，参考iScriptTMcDNA Synthesis Kit试剂盒（Bio-Rad公司）说明书，逆转录RNA生成cDNA，在CFX Manager System上以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR操作。NCAM引物序列（上游：5'-ACTGGAACGCCGAGTACGAA-3'，下游：5'-TGACAATGAGGATGCCCACAA-3'）；β-actin引物序列（上游：5'-TGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3'，下游：5'-TGCTAGGAGCCAGGGCAGTAA-3'）。设置实时荧光定量PCR反应条件：2 min预变性、95℃，45 s变性、95℃下进行35次循环，30 s退火、57.5℃下进行35次循环，35 s延伸、72℃下进行35次循环，5 min延伸、72℃。选用2-△△Ct方法计算NCAM mRNA相对表达量。

1.2.6 Western Blot

依据试剂盒说明书，配制含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，称量小脑组织50 mg，冰上研磨，加1 000 μl RIPA裂解液冰上裂解小脑组织30 min，待蛋白变性后，提取小脑总蛋白，使用BCA混合液对小脑蛋白浓度进行测定，按照目的蛋白的大小制作SDS聚丙烯酰胺凝胶，常规上样，用梯度电泳分离蛋白，采用恒流湿转法对小脑分离蛋白进行转膜（电流400 mA，1 h），8%的脱脂奶粉进行封闭1 h、室温摇匀，加NCAM1小鼠单克隆抗体一抗（1：1 000）4℃孵育并过夜、时间长于8 h，TBST洗膜3次、每次10 min，加HRP标记的兔抗小鼠IgG二抗（1：4 000）37℃孵育60 min，TBST洗膜3次、每次10 min，采用ECL法，暗室曝光胶片，先显影后定影，漂洗胶片，完全干燥后用Quantity one软件分析图片。

1.2.7 统计学分析

采用软件SPSS19.0分析数据结果，实验数据之间的对比采用单因素方差分析，计量资料按照均值±标准差（±s）表示，选用偏相关分析法（partial correlation）分析大鼠空间学习记忆能力和小脑NCAM表达的相关性，P＜0.05表示差异有统计学意义，P＞0.01表示差异显著。

2 结果

2.1 两种游泳训练后大鼠空间学习及记忆能力的变化

如图1所示，Morris水迷宫定位航行实验结果显示，与正常组比较，中等负荷运动组在第1 d的定位航行实验过程中耗时较短，其平均逃避潜伏期显著降低（P＜0.01），同时中等负荷运动组平均潜伏耗时相较于高度负荷运动组同样显著降低（P＜0.01）；而高度负荷运动组和正常组第1 d的潜伏耗时相比，无显著变化（P＞0.05）；第3 d之后，三组大鼠耗时趋于稳定，平均潜伏耗时相差不大（P＞0.05）。Morris水迷宫空间探索实验结果显示（见图2），和正常组对比，中等负荷运动组大鼠平均穿过原站台位置的次数明显提高（P＜0.05），与正常组和中等负荷运动组相比，高度负荷运动组大鼠平均穿越原站台所处位置的次数显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。上述结果提示，中等负荷游泳运动可以增强大鼠空间学习记忆能力，但过高的运动负荷使大鼠空间记忆能力出现衰退。

2.2 不同强度运动模型的验证

为了检验大鼠不同强度运动模型是否成功，我们对大鼠的血睾酮含量进行测定。ELISA结果显示（见表1），与正常组、中等负荷运动组比较，高度负荷运动组血睾酮水平显著降低（P＜0.01，P＜0.01）；与正常组比较，中等负荷运动组血睾酮水平显著升高（P＜0.01）。上述结果表明，中等负荷和高度负荷运动造模成功。

表1大鼠血清睾酮水平（x±s）Table1 Level of serum testosteroneof rats（x±s）

图1每组大鼠逃避潜伏期Figure 1 Escapelatency of each group of rats注：“*”：和“控制”比较，P＜0.01；“#”：和MT比较，P＜0.01。下同。

图2大鼠穿越平台次数结果Figure 2 The results of passing times of rats

2.3 运动对大鼠小脑NCAM mRNA表达的影响

real time RT-PCR结果显示（见表2），中等负荷运动组比正常组NCAM mRNA增高显著（P＜0.05）；高度负荷运动组NCAM mRNA与中等负荷运动组对比，呈现出明显地降低（P＜0.05），但和正常组NCAM mRNA比较，无明显变化（P＞0.05）。表明中等负荷游泳运动可使大鼠小脑NCAMmRNA表达增高。

表2各组大鼠小脑NCAM mRNA相对表达量（x±s）Table 2 The relative expression of NCAM mRNA in cerebellum of each group of rats（x±s）

2.4 运动对大鼠小脑NCAM蛋白表达的影响

Western Blot结果显示（见图3、表3），与正常组对比，中等负荷运动组小脑NCAM蛋白表达量显著增高（P＜0.05）；和中等负荷运动组对比，高度负荷运动组小脑NCAM蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；高度负荷运动组小脑NCAM蛋白表达量与正常组对比无显著差异（P＞0.05）。表明中等负荷游泳运动能显著提高大鼠小脑NCAM蛋白表达。

图3大鼠小脑NCAM蛋白表达条带图Figure 3 The band diagram of NCAM protein in cerebellum of rats

表3大鼠小脑NCAM蛋白相对表达量（x±s）Table 3 The relative expression of NCAM protein in cerebellum of rats（x±s）

2.5 小脑NCAM表达和大鼠空间学习及记忆能力的相关性

采用偏相关分析，我们进一步探索大鼠小脑NCAM的表达量和平均潜伏用时以及穿越站台所处位置次数的关系。偏相关分析结果显示：三组大鼠小脑中NCAM蛋白表达量和平均潜伏用时成负相关（r=-0.726，P=0.041）；三组大鼠小脑中NCAMmRNA表达量和平均潜伏用时成负相关（r=-0.750，P=0.032）；三组大鼠小脑中NCAM蛋白表达量和穿越站台所处位置的次数成正相关（r=0.714，P=0.047）；三组大鼠小脑中NCAM mRNA表达量和穿越站台所处位置的次数成正相关（r=0.774，P=0.024）。提示小脑NCAM表达和大鼠空间学习记忆能力具有一定关联。

3 讨论

在运动训练中，睾酮常作为监测人体机能和负荷量的一项重要指标［15-16］。相关基础研究发现［17］，大鼠进行3周的中等强度跑台训练（跑速为20 m/min，1 h/d）后，其血睾酮含量上升明显。另外，也有研究证实，持续5周过度游泳训练（负自身体重3.5%，90 min/d）的大鼠，尽管经过24 h的充分休息，但其血睾酮含量依然显著下降［18］。由此可知：血睾酮含量可作为大鼠运动建模效果的一个验证指标。本研究采用ELISA实验检测大鼠血睾酮含量变化，空间探索实验结束后，中等负荷运动组和高度负荷运动组大鼠自然喂养24 h，结果显示，高度负荷运动组大鼠血睾酮含量显著低于正常组，可见大鼠8周的高度负荷训练降低了其血睾酮含量，实验研究结果与预想的运动干预结果相吻合，8周的高度负荷运动建模可靠；中等负荷运动组大鼠经过24 h的休息，理论上其机体得以恢复，与正常组相比，中等负荷运动组大鼠血睾酮值出现明显升高，可见中等负荷运动组大鼠建模理想。

研究发现，大鼠学习和认知能力会受到运动负荷量多寡的影响，对大鼠进行8周的适量强度训练可提高低氧暴露大鼠的学习记忆能力［19］，而12月龄老年雄性大鼠经过8周大负荷训练后，其认知能力出现明显下降［20］。为探究运动负荷量对大鼠空间学习和记忆能力的影响，我们对大鼠进行递增负荷游泳运动建模，并利用水迷宫实验进行探索。结果显示，与正常组相比，中等负荷运动组大鼠在第1 d的定位航行过程中耗时较短，平均逃避潜伏期显著降低，表现出更加优秀的空间学习能力，研究结果与文献报道相一致［19］。有趣的是，虽然高度负荷运动组大鼠第1 d平均逃避潜伏期较中等负荷运动组升高明显，但和正常组相比未出现明显升高，高度负荷运动没有明显降低大鼠空间学习能力。从第2 d开始，3组大鼠的潜伏耗时互相比较，无明显差异，但和第1 d相比，3组大鼠平均潜伏用时均下降明显，这种现象一直持续到第3 d；从第4 d起，3组大鼠耗时趋于稳定，定位导航能力和前1 d比较，相差不大。可见，在Morris水迷宫中，定位航行练习可使大鼠空间学习能力得以提高。中等负荷运动组大鼠在空间探索实验中平均穿越平台的次数比正常组明显提高，说明其空间记忆能力表现优异；高度负荷运动组大鼠平均穿越原平台所处位置的次数较正常组明显降低，证明了高度负荷游泳运动会导致空间记忆能力下降。

本课题组证明运动负荷量的差异确实会对大鼠空间学习和记忆能力产生不同的影响。然而运动调控大鼠学习和记忆能力是通过哪个脑区来实现的？这一具体调控途径又是什么呢？研究发现，空间学习和记忆能力除了受海马和内嗅皮质支配外［2］，还受到小脑的调控［4］。

Colombel等［21］研究发现，对大鼠小脑半球实行切除术后，大鼠在Morris水迷宫中空间学习能力明显受损；Tuma等［22］证实，在Morris水迷宫中，Lurcher小鼠和小脑蒲肯野细胞变异小鼠寻找平台所用的逃避潜伏期更长；同样有基础实验证明，小脑蒲肯野细胞受损（L7-PP2B转基因小鼠）可以导致空间导航和定位能力障碍［5］，这些实验表明小脑在空间学习与记忆过程中是十分重要的。为了进一步探究，本文试图引入一种糖蛋白——NCAM。NCAM作为免疫球蛋白超家族中一种细胞表面大分子，在轴突导向发育中起着重要的作用，它对神经细胞突触的可塑性和学习记忆的形成也产生重要的影响。有研究发现，在亚长期应激刺激下，NCAM基因缺陷小鼠会产生一种压抑性的行为，悬尾实验出现移动不灵活现象，Morris水迷宫空间学习和记忆能力受损［7］。相反，7周中等负荷运动后，大鼠在水迷宫中逃避潜伏耗时显著缩短，并且其海马NCAM表达得到显著提高，大鼠的空间学习和记忆能力也得到改善［12］。另外，对脑部衰老大鼠加以有氧运动调控，发现该手段可改善大鼠空间学习和记忆能力并提高其NCAM表达［23］。NCAM的表达因N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体活化而诱导转录，在神经元突触传递过程中，NCAM180与膜收缩蛋白细胞骨架发生联系，并在嗜同性的相互作用下，大量的NCAM分子从突触外位点弥散到突触后膜，促进NCAM在突触过程中集聚。在长时程增强（long-term potentiation，LTP）的诱导下，NCAM（特别是NCAM180）在突触后膜上表达升高［7，24］。原位杂交和免疫荧光结果表明，NCAM在小脑蒲肯野细胞中有表达，并且NCAM的表达与轴突的生长有关，尤其在突触稳定性方面表现出重要作用［25］。由于学习记忆产生的机制是突触可塑性，而NCAM表达与突触可塑性密切相关，综合上述文献研究，我们推断游泳运动干预大鼠学习记忆能力可能和NCAM在小脑内的表达量有关。为了验证猜想，我们进行了Western Blot和real time RT-PCR实验，结果显示，适宜强度的游泳运动训练后，小脑NCAM表达量会明显升高，在中等负荷强度基础上，随着负荷量增大和游泳时间的延长，小脑NCAM表达量未出现降低。采用偏相关分析，进一步求证空间学习记忆能力和大鼠小脑中NCAM表达的关系，发现中等负荷游泳运动可通过调高小脑NCAM表达来实现大鼠空间学习和记忆能力的改善；高度负荷游泳运动后，大鼠空间记忆能力出现减弱，但空间学习能力未明显降低，这和高度负荷运动组小脑NCAM的表达有关，揭示长期高度负荷游泳训练后，大鼠小脑在学习引起的突触网络结构重塑中出现某种代偿，可能的机制是小脑NCAM参与修复高度负荷带来的神经损伤［26］。

在行为学习条件下，突触的结构可塑性表现为树突棘更新速度加快、数目增多、细小的树突棘在较大的树突棘周围形成环状簇，树突棘的形态会变得大而稳定［6］。另外，从突触的功能可塑性表现形式看，其生理学机制是LTP和长时程抑制（lon-term depression，LTD），它们分别负责突触的强化和弱化［27］，而且已有证据表明，在平行纤维和蒲肯野细胞突触之间的长时程抑制LTD是小脑运动学习的神经联系［28］。那么在Morris水迷宫实验中，经过运动干预后的大鼠，其小脑神经元的树突棘在数量和形态上会发生怎样的变化呢？大鼠在进行空间学习和记忆任务时，小脑平行纤维到蒲肯野细胞之间的突触功能可塑性如何？NCAM表达量的增减会不会影响小脑电生理变化呢？这些问题有待进一步追踪并研究。