STEMI患者PCI治疗前外周血miR-1、miR-21表达水平与细胞因子、氧化应激及治疗后冠状动脉再狭窄的关系△

曹位平，王盛尧，罗永全，童素霞，韩莉莎

（1.四川省乐山市人民医院心内科，四川乐山 614000；2.资阳市第一人民医院心血管内科，四川资阳 641300）

经皮冠状动脉介入（percutaneous coronary inter⁃vention，PCI）治疗是急诊治疗ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STE⁃MI）患者的常用方式，能够有效再通冠状动脉、恢复心肌血流灌注，但治疗后再狭窄的发生会影响PCI治疗的远期疗效［1］。PCI治疗后再狭窄的发生机制复杂，涉及多种生物学通路功能的异常，其中支架植入对局部血管内皮结构的损伤、再内皮化过程的障碍被认为与PCI治疗后再狭窄的发生密切相关［2］。心肌发生缺血缺氧后，局部炎症反应及氧化应激反应过度激活所引起的炎症细胞因子、氧自由基大量释放能够损害血管内皮，血管新生细胞因子分泌异常则不利于内皮细胞的增殖，两方面因素共同引起了再内皮化的障碍［3-4］，但调控细胞因子及氧化应激的机制尚不明确。微小RNA（micro RNA，miR）中的miR-1和miR-21被证实在心血管系统中发挥重要的调节作用，对心肌细胞、内皮细胞的凋亡、增殖、迁移等行为均具有调节作用。国内王红［5］的研究证实miR-1和miR-21对PCI治疗后再狭窄具有预测价值，但以上两种miR是否影响PCI治疗后再内皮化的相关环节尚未明确。为此，本研究具体分析了PCI治疗前外周血miR-1、miR-21表达水平与冠状动脉再狭窄及细胞因子、氧化应激的相关性。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2015年2月至2017年5月期间在乐山市人民医院进行急诊PCI治疗的STEMI患者110例为研究对象。入选标准：（1）符合STEMI的诊断标准及急诊PCI治疗的指征；（2）PCI治疗前均留取外周血标本；（3）PCI治疗后完整随访1年。根据随访1年内是否发生再狭窄分为发生再狭窄的A组和未发生再狭窄的B组；另取同期体检的60名健康者作为对照组。A组共34例，包括男21例、女13例，年龄42～65岁；B组共86例，包括男48例、女38例，年龄40～62岁；对照组共60名，包括男35名、女25名，年龄44～66岁。3组研究对象间年龄、性别构成比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。研究取得医院伦理委员会批准及受试者知情同意。

1.2 试剂与仪器

MiR提取试剂盒、miR cDNA第一链合成试剂盒、miR荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测试剂盒均购自北京天根公司，酶联免疫吸附试剂盒购自上海西唐公司，硫代巴比妥酸试剂盒、黄嘌呤氧化酶试剂盒购自南京建成研究所，荧光定量PCR仪购自Bio-rad公司。

1.3 再狭窄的随访

PCI治疗患者进行为期1年的术后随访，分别于术后1、3、6、9、12个月门诊复查心电图、血常规、肝及肾功能、超声心动图等并在治疗后第9～12个月复查冠状动脉造影，造影结果若提示支架内或支架两端5 mm范围内的管腔狭窄超过50%，则判断为再狭窄。

1.4 微小RNA表达水平的测定

PCI治疗前采集患者的肘静脉血2 mL，按照miRNA提取试剂盒进行操作并分离外周血中的miR，按照miR cDNA第一链合成试剂盒进行操作并将外周血中的miR反转录为cDNA，放置在-20℃保存；最后按照miR荧光定量PCR检测试剂盒进行操作，设计miR-1、miR-21的引物并对反转录得到的cDNA进行PCR，根据反应曲线计算miR-1、miR-21的表达水平。

1.5 细胞因子及氧化应激指标的测定

PCI治疗前采集患者的肘静脉血3～4 mL，在装有分离胶和促进剂的管中离心分离血清，而后按照酶联免疫吸附试剂盒进行操作并测定血管生成素-2（angiopoietin，Ang-2）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-8、高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）、8-羟基脱氧鸟苷酸（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OhdG）的浓度，按照硫代巴比妥酸试剂盒进行操作并测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）浓度，按照黄嘌呤氧化酶试剂盒进行操作并测定谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的浓度。

1.6 统计学分析

采用SPSS 21.0软件录入数据。miR、细胞因子、氧化应激指标均属于计量资料，以（）表示，两组间比较采用t检验。再狭窄率为计数资料，采用［n（%）］表示，两组间比较采用卡方（χ2）检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同miR-1、miR-21表达水平患者再狭窄发生率的比较

以miR-1、miR-21表达水平的中位数为标准，将PCI治疗患者分为高miR-1、miR-21表达水平和低miR-1、miR-21表达水平。高miR-1表达水平PCI治疗患者的再狭窄发生率明显低于低miR-1表达水平PCI治疗患者［18.33%（11/60）vs.38.33%（23/60），χ2=5.910，P=0.015］，而高miR-21表达水平PCI治疗患者的再狭窄发生率明显高于低miR-21表达水平PCI治疗患者［36.7%（22/60）vs.20%（12/60），χ2=4.104，P=0.043］，差异有统计学意义。

2.2 3组研究对象外周血miR-1、miR-21表达水平的比较

与对照组比较，A组和B组患者的外周血miR-1表达水平均明显降低，miR-21表达水平均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B组比较，A组患者的外周血miR-1表达水平均明显降低，miR-21表达水平均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表1。

表1 3组研究对象外周血miR-1、miR-21表达水平比较 ［］

表1 3组研究对象外周血miR-1、miR-21表达水平比较 ［］

注：与对照组比较，*P＜0.05；与B组比较，1）*P＜0.05

2.3 3组研究对象血清细胞因子浓度比较

与对照组比较，A组和B组患者的血清Ang-2、IL-1、IL-8、HMGB1浓度均明显升高，VEGF浓度明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B组比较，A组患者的血清Ang-2、IL-1、IL-8、HMGB1浓度均明显升高，VEGF浓度明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表2。

表2 3组研究对象血清细胞因子浓度比较 ［］

表2 3组研究对象血清细胞因子浓度比较 ［］

注：与对照组比较，*P＜0.05；与B组比较，1）*P＜0.05

2.4 3组研究对象血清氧化应激浓度比较

与对照组比较，A组和B组患者的血清MDA、8-OhdG浓度均明显升高，GPX、SOD浓度明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B组比较，A组患者的血清MDA、8-OhdG浓度均明显升高，GPX、SOD浓度明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表3。

表3 3组研究对象血清氧化应激指标浓度的比较

3 讨论

STEMI是心血管系统的常见急症，以冠状动脉闭塞、心肌缺血缺氧坏死为特点，早期再通冠状动脉是治疗疾病的关键。急诊PCI能够有效再通血管，短期疗效确切，但术后远期冠脉再狭窄会影响远期疗效［6-7］。目前关于PCI治疗后冠状动脉再狭窄的研究认为，支架局部再内皮化障碍与再狭窄的发生密切相关，而影响再内皮化过程的病理环节包括血管新生、炎症反应、氧化应激等［8-9］，但调控上述病理环节的机制仍未明确。MiRs是具有广泛生物学作用的小分子RNA，本身不具备编码蛋白质的功能，但却能影响多种基因的表达和蛋白的编码。MiR-1和miR-21是两种在心血管系统中发挥多种调节作用的miR，miR-1具有细胞保护作用、而miR-21具有细胞损伤作用［10-11］。国内王红［5］的研究证实miR-1的低表达和miR-21的高表达对PCI治疗后再狭窄具有预测价值，本研究对PCI治疗后冠状动脉再狭窄及PCI治疗前miR-1、miR-21表达水平的分析结果与王红的研究一致，高miR-1表达水平及低miR-21表达水平PCI治疗患者的再狭窄发生率较高且发生再狭窄的A组患者外周血miR-1表达水平明显降低、miR-21表达水平明显升高。由此提示miR-1表达水平的减少、miR-21表达水平的增多与PCI治疗后远期冠状动脉再狭窄的发生有关。

MiR-1和miR-21并不直接影响心血管系统，而是通过影响靶基因的表达来发挥相应的生物学功能。在心血管系统中，miR-1及miR-21能够调节多种血管新生细胞因子、炎症细胞因子的分泌以及氧自由基的生成。STEMI患者接受PCI治疗后，支架对冠状动脉局部的血管内皮具有损伤作用，需要通过内皮细胞在局部的迁移、增殖来完成再内皮化；而当内皮细胞受到损伤时，支架局部的再内皮化无法顺利完成，损伤的血管内皮持续暴露并不断刺激血小板活化聚集，最终形成血栓并导致再狭窄［12-13］。Ang-2和VEGF是两种调节内皮细胞增殖的细胞因子，前者能够诱导内皮细胞发生凋亡、后者则能促进内皮细胞增殖［14-16］，本研究对两种细胞因子的分析发现：发生再狭窄的A组患者血清Ang-2浓度明显高于未发生再狭窄的B组、VEGF浓度则明显低于未发生再狭窄的B组。结合分析细胞因子与miR-1、miR-21的相关性可知：再狭窄患者的Ang-2与miR-1呈负相关、与miR-21呈正相关，VEGF与miR-1呈正相关、与miR-21呈负相关。由此表明PCI治疗前miR-1表达的减少、miR-21表达的增多能够增加内皮损伤细胞因子Ang-2的分泌、减少内皮保护细胞因子VEGF的分泌，进而影响PCI治疗后的再内皮化过程并参与冠状动脉再狭窄的发生。

STEMI的局部心肌组织在经历缺血缺氧及PCI治疗后的再灌注后，炎症细胞因子及氧自由基均大量生成并通过炎症反应、氧化应激反应来引起血管内皮发生损害，炎症及氧化应激的程度越重、内皮损害程度越重，进一步也会加重再内皮化障碍的程度。IL-1、IL-8、HMGB1是在炎症反应过程中起到重要作用的炎症细胞因子，能够在心肌梗死局部组织及冠状动脉支架植入部位招募炎症细胞，介导炎症反应对心肌细胞、内皮细胞的损害［17-18］。MDA、8-OhdG是氧化应激过程中氧自由基与心肌细胞、内皮细胞中脂质、鸟嘌呤发生氧化反应的产物，GPX和SOD则是氧化应激过程中发挥抗氧化作用的代谢酶，并且能够被持续生成的氧自由基大量消耗，氧化产物的增多及抗氧化酶的减少能够反映氧化应激损伤的加重［19-20］。本研究对炎症细胞因子及氧化应激指标的分析发现：发生再狭窄的A组患者血清IL-1、IL-8、HMGB1、MDA、8-OhdG浓度明显高于未发生再狭窄的B组，GPX、SOD浓度则明显低于未发生再狭窄的B组。结合分析细胞因子与炎症细胞因子及氧化应激指标的相关性可知：再狭窄患者的IL-1、IL-8、HMGB1、MDA、8-OhdG与miR-1呈负相关、与miR-21呈正相关，GPX、SOD与miR-1呈正相关、与miR-21呈负相关。由此表明，PCI治疗前miR-1的表达减少、miR-21的表达增多能够使炎症反应及氧化应激反应加剧，加重内皮损伤来影响再内皮化过程，进而参与冠状动脉再狭窄的发生。

综上所述，PCI治疗前外周血miR-1的表达减少、miR-21的表达增多与治疗后远期冠状动脉再狭窄的发生有关，同时miR-1及miR-21的改变与再内皮化相关的细胞因子分泌、氧化应激异常有关。