早老素-1 p.Met139Ile突变对SH-SY5Y细胞模型相关蛋白与miR-34a表达影响

孙雪纯　杨绍楠　王源　张雅梦　潘旭东　马爱军

[摘要]目的探讨早老素-1（PSEN-1）p.Met139Ile突变对早发性阿尔茨海默病（EOAD）人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）模型中相关蛋白及microRNA-34a（miR-34a）表达的影响。方法分别将携带有阴性对照空载体的慢病毒（NC组）、野生型PSEN-1的慢病毒（WT组）以及突变型PSEN-1 p.Met139Ile（c.417G>C）的慢病毒（MT组）转染至SH-SY5Y细胞，以未感染慢病毒细胞作为正常组（N组）。ELISA方法检测各组细胞β-淀粉样蛋白表达（Aβ42/Aβ40值），Western blot方法检测各组PSEN-1、淀粉样蛋白前体（APP）、NOTCH-1蛋白的表达，qRT-PCR方法检测各组miR-34a的表达。结果与N组、NC组、WT组比较，MT组Aβ42/Aβ40值、PSEN-1蛋白、APP蛋白及miR-34a表达升高，而NOTCH-1蛋白表达下调，差异有显著性（F=28.540～425.600，q=7.349～30.180，P<0.05），N组、NC组、WT组各指标比较差异无显著性（P>0.05）。结论PSEN-1 p.Met139Ile为致病性突变位点，可引起SH-SY5Y细胞模型中相关蛋白及miR-34a的异常表达。

[关键词]早老素-1;阿尔茨海默病;淀粉样β肽类;微RNAs

[中图分类号]R745.7[文献标志码]A[文章编号]2096-5532（2021）01-0087-04

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the influence of presenilin-1 （PSEN-1） p.Met139Ile mutation on the expression of related proteins and microRNA-34a （miR-34a） in a model of human neuroblastoma SH-SY5Y cells in early-onset Alzheimers di-sease. MethodsSH-SY5Y cells were transfected with the lentivirus carrying negative control （NC group）， the lentivirus carrying wild-type PSEN-1 （WT group）， and the lentivirus carrying mutant-type PSEN-1 p.Met139Ile （c.417G>C） （MT group）， and the cells not transfected with lentivirus were established as normal group （N group）. ELISA was used to measure the expression of amyloid β-proteins （Aβ42/Aβ40 ratio）; Western blot was used to measure the protein expression of PSEN-1， amyloid precursor protein （APP）， and NOTCH-1; qRT-PCR was used to measure the expression of miR-34a. ResultsCompared with the N， NC， and WT groups， the MT group had significant increases in Aβ42/Aβ40 ratio and expression of PSEN-1， APP， and miR-34a and a significant reduction in the expression of NOTCH-1 （F=28.540-425.600，q=7.349-30.180，P<0.05）， while there were no significant differences in these indices between the N， NC， and WT groups （P>0.05）. ConclusionPSEN-1 p.Met139Ile is a pathogenic mutation site and can cause abnormal expression of related proteins and miR-34a in the model of SH-SY5Y cells.

[KEY WORDS]presenilin-1; Alzheimer disease; amyloid beta-peptides; microRNAs

早發性阿尔茨海默病（EOAD）常由早老素-1（PSEN-1）、PSEN-2和淀粉样蛋白前体（APP）等基因的突变导致[1]，其中PSEN-1突变占70%～80%[2]。PSEN-1作为γ-分泌酶的重要组成部分，其突变会影响APP、NOTCH-1以及β-淀粉样蛋白（Aβ）的表达[1，3]。微小RNA（miRNA）是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过识别靶基因mRNA的3′端非编码区（3′UTR），并与之结合以抑制靶基因的表达[4]。最近研究结果表明，多种miRNA参与调控阿尔茨海默病（AD）的病理过程，miR-101、miR-106靶向APP可促进Aβ产生[5]。 既往我们在一家族性EOAD家系中发现存在PSEN-1 p.Met139Ile（c.417G>C）突变，本研究在体外建立PSEN-1 p.Met139Ile（c.417G>C） 突变人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）模型，分别检测其Aβ42/Aβ40、PSEN-1、APP、NOTCH-1及microRNA-34a（miR-34a）的表达，以探讨PSEN-1 p.Met139Ile（c.417G>C）突变对SH-SY5Y细胞模型的影响。现将结果报告如下。

1材料和方法

1.1细胞培养

SH-SY5Y细胞购自上海中乔新舟公司，培养于含体积分数0.44的MEM、体积分数0.44的F12、体积分数0.10的胎牛血清、体积分数0.01的双抗及体积分数0.01的丙酮酸钠培养液中，在37 ℃、含体积分数0.05的CO2细胞培养箱中培养。本实验所用细胞的传代次数均控制在P10～P30之间。

1.2实验分组及处理

将处于对数生长期的SH-SY5Y细胞接种于96孔板，细胞生长汇合度在20%～30%时，随机分为N组（正常细胞组，未感染慢病毒）、NC组（阴性对照组，感染携带有阴性空载体的慢病毒）、WT组（野生型PSEN-1组，感染携带有野生型PSEN-1的慢病毒）、MT组（突变型PSEN-1组，感染携带有突变型PSEN-1 p.Met139Ile（c.417G>C）的慢病毒）。各组分别将相应的慢病毒感染至SH-SY5Y细胞中，同时更换培养液为无血清培养液，培养12 h后更换为常规培养液继续培养。慢病毒感染约96 h后，将细胞继续培养于含3 mg/L嘌呤霉素的培养液中，每3～4 d更换1次含嘌呤霉素的培养液，直至未感染病毒的N组细胞被杀光，将嘌呤霉素浓度减至维持浓度（1 mg/L），继续对感染后的细胞进行筛选和扩增。同时，收集细胞分别进行DNA测序鉴定，并将鉴定结果正常的细胞冻存保种。慢病毒购自上海吉凯基因科技有限公司。

1.3DNA提取和测序

使用细胞基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取各组细胞基因组的DNA。使用分光光度计测DNA浓度。DNA扩增引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。上游引物：5′-ATACCGAGAC-TGTGGGCCAG-3′，下游引物：5′-ATGAGCCACG-CAGTCCATTC-3′。按照2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）说明书进行PCR扩增。扩增后的产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，将DNA扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行基因测序。

1.4检测指标及方法

1.4.1Aβ42/Aβ40表达应用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，按照ELISA试剂盒（Elabscience）说明书进行操作。用酶标仪检测450 nm波长处光密度（OD）值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在双对数坐标纸上绘制四参数逻辑函数的标准曲线，计算各组Aβ40和Aβ42的表达。

1.4.2PSEN-1、APP、NOTCH-1蛋白表达采用Western blot方法检测。应用RIPA缓冲液+蛋白酶抑制剂（体积比为100∶1）对各组细胞进行裂解。应用BCA试剂盒测定收集到的蛋白质浓度。蛋白样本与上样缓冲液混合后煮沸变性，然后在不连续的聚丙烯酰胺凝胶（分别为100 g/L的聚丙烯酰胺分离凝胶和50 g/L的聚丙烯酰胺浓缩凝胶）中进行电泳，将凝胶中的蛋白质带转移到PVDF膜上。使用50 g/L的脱脂牛奶在室温下进行封闭，将负载蛋白的PVDF膜分别用原代羊抗兔抗体PSEN-1（1∶1 000）、APP（1∶1 000）、NOTCH-1 （1∶1 000）孵育，用HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶5 000） 室温孵育1～2 h。用蛋白凝胶成像仪检测PSEN-1、APP、NOTCH-1蛋白，应用Image J软件计算各蛋白的表达结果。

1.4.3miR-34a表达应用TRIzol方法提取各组细胞总RNA，采用分光光度计测定RNA浓度。应用microRNA专用反转录试剂盒（Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis and SYBRR qRT-PCR User Manual，TAKARA公司）反轉录得到microRNA的cDNA产物。按照TB Green Premix Ex TaqⅡ说明书，应用两步法进行qRT-PCR扩增。以U6基因作为内参对照。以2-ΔΔCt法计算各组miR-34a的表达。

以上所有指标检测均重复3次。

1.5统计学方法

应用SPSS Version 21.0软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料结果以±s表示，两组比较采用t检验;多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用q检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1慢病毒转染后SH-SY5Y细胞基因测序

荧光显微镜下观察显示，慢病毒对SH-SY5Y细胞的感染效率在80%以上（图1A）。序列分析显示，WT组细胞在PSEN-1的417位点发生G→C突变，即第5号外显子的139号密码子发生ATG→ATC错义突变（图1B、C）。

2.2各组Aβ42/Aβ40值比较

MT组Aβ42/Aβ40值明显高于N组、NC组、WT组，差异有显著意义（F=119.700，q=14.680～16.150，P<0.05）。N组、NC组、WT组Aβ42/Aβ40值比较差异均无显著性（P>0.05）。见表1。

2.3各组PSEN-1、APP、NOTCH-1蛋白表达比较

与N组、NC组和WT组比较，MT组PSEN-1和APP蛋白表达升高，NOTCH-1蛋白表达水平显著降低，差异有显著性（F=90.680～425.600，q=12.120～30.180，P<0.05）。N组、NC组和WT组PSEN-1、APP、NOTCH-1蛋白表达比较差异无显著性（P>0.05）。见图2、表1。

2.4各组miR-34a表达比较

MT组miR-34a表达明显高于N组、NC组和WT组，差异有显著统计学意义（F=28.540，q=7.349～7.762，P<0.05）。N组、NC组和WT组miR-34a比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。

目前已有超過200种PSEN-1突变对EOAD来说是致病性的[6]，在致病性PSEN-1突变中，大多数为错义突变导致氨基酸的替换。本团队首次发现在PSEN-1的417位点发生G→C突变，致使第5号外显子的139号密码子发生ATG→ATC错义突变，从而导致该密码子编码的氨基酸由蛋氨酸（Met）突变为异亮氨酸（Ile）。本文进一步研究该突变位点的致病功能：首先通过慢病毒感染该突变位点至SH-SY5Y细胞，基因测序验证SH-SY5Y细胞模型构建成功;ELISA方法检测显示AD的特征性指标Aβ42/Aβ40值升高，Western blot方法检测显示APP、PSEN-1蛋白表达升高，这与AD病理变化相符合，进一步验证了体外SH-SY5Y细胞模型构建成功，也证实了PSEN-1 p.Met139Ile （c.417G>C）这一突变位点为致病性突变。

AD的重要病理特征是脑内Aβ沉积形成的老年斑，具体表现为Aβ42/Aβ40的比值增加。Aβ是由APP经γ-分泌酶剪切所产生，γ-分泌酶的主要催化亚基为PSEN-1，研究认为，突变型PSEN-1在切割APP时易形成更多的Aβ42，从而使Aβ42/Aβ40值升高。还有研究发现，γ-分泌酶也参与剪切神经信号传导通路上的重要蛋白，如NOTCH等[7-8]。Notch信号通路中，γ-分泌酶将NOTCH切割后，胞内片段（NICD）转移到核内激活基因的转录，调节神经细胞的生成、分化以及存活。研究结果显示，AD的病因之一可能是γ-分泌酶切割APP释放的APP胞内结构域（AICD）产物抑制了Notch通路[7]。作为γ-分泌酶的重要组成部分，PSEN-1突变可阻断NOTCH-1剪切及核转位，NOTCH-1蛋白减少可能使淀粉样蛋白积聚导致神经细胞易于凋亡，其机制可能与相应微环境支持及神经细胞自身端粒酶活性限制有关。也有研究认为NOTCH-1蛋白下调可能影响海马突触的可塑性，进而导致记忆障碍[8]。本文研究显示，在PSEN-1 p.Met139Ile （c.417G>C）突变的SH-SY5Y细胞模型中Aβ42/Aβ40比值、PSEN-1蛋白、APP蛋白的表达升高，NOTCH-1蛋白表达下降，推测PSEN-1 p.Met139Ile （c.417G>C）突变位点为致病性突变位点，可以造成AD的病理改变，致使Aβ42/Aβ40值增高。已有研究显示，多种miRNAs，如miR-124、miR-107、miR-29等参与AD的病理过程[9]。近期有研究发现，AD病人血浆中miR-34a升高，认为其可以作为AD的生物标志物[10]。本文结果显示miR-34a表达上调，与相关研究结果相符[9-10]。miR-34a表达升高具体机制尚不十分明确，可能是抑制神经元突触可塑性、氧化磷酸化和糖酵解等相关基因所致[11-12]。研究显示，miR-34a通过调节AD双转基因小鼠模型Bcl-2的表达而引起AD细胞凋亡[13];miR-34a通过调控NOTCH-1增加肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤进展[14-15]。然而，miR-34a及NOTCH-1蛋白在EOAD中作用的研究未见报道。后续我们将进一步研究miR-34a与NOTCH-1蛋白在EOAD细胞模型中的作用及其机制，为EOAD的治疗提供依据。

综上，转染PSEN-1 p.Met139Ile （c.417G>C）突变位点可在体外成功构建SH-SY5Y细胞模型，对该细胞模型研究显示Aβ42/Aβ40值、PSEN-1蛋白、APP蛋白、miR-34a表达升高，NOTCH-1蛋白表达下降。认为PSEN-1 p.Met139Ile （c.417G>C）突变位点为EOAD致病性突变位点，miR-34a可能通过与NOTCH-1蛋白作用参与调控EOAD的病理机制。

[参考文献]

[1]WINGO T S， LAH J J， LEVEY A I， et al. Autosomal recessive causes likely in early-onset Alzheimer disease[J].  Archives of Neurology， 2012，69（1）：59-64.

[2]SASSI C， GUERREIRO R， GIBBS R， et al. Investigating the role of rare coding variability in Mendelian dementia genes （APP， PSEN1， PSEN2， GRN， MAPT， and PRNP） in late-onset Alzheimers disease[J].  Neurobiology of Aging， 2014，35（12）：2881.e1-2881.e6.

[3]LOHMANN E， GUERREIRO R J， ERGINEL-UNALTUNA N， et al. Identification of PSEN1 and PSEN2 gene mutations and variants in Turkish dementia patients[J].  Neurobiology of Aging， 2012，33（8）：1850.e17-1850.e27.

[4]PAULI A， RINN J L， SCHIER A F. Non-coding RNAs as regulators of embryogenesis[J].  Nature Reviews Genetics， 2011，12（2）：136-149.

[5]SCHONROCK N， GTZ J. Decoding the non-coding RNAs in Alzheimers disease[J].  Cellular and Molecular Life Sciences： CMLS， 2012，69（21）：3543-3559.

[6]LANOISELE H M， NICOLAS G， WALLON D， et al. APP， PSEN1， and PSEN2 mutations in early-onset Alzheimer disease： a genetic screening study of familial and sporadic cases[J].  PLoS Medicine， 2017，14（3）：e1002270.

[7]RONCARATI R， SESTAN N， SCHEINFELD M H， et al. The Gamma-secretase-generated intracellular domain of beta-amyloid precursor protein binds Numb and inhibits Notch signaling[J].  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2002，99（10）：7102-7107.

[8]MARATHE S， ALBERI L. Notch in memories： points to remember[J].  Hippocampus， 2015，25（12）：1481-1488.

[9]ALEXANDROV P N， DUA P， HILL J M， et al. microRNA （miRNA） speciation in Alzheimers disease （AD） cerebrospinal fluid （CSF） and extracellular fluid （ECF）[J].  International Journal of Biochemistry and Molecular Biology， 2012，3（4）：365-373.

[10]JIAN C D， LU M R， ZHANG Z， et al. miR-34a knockout attenuates cognitive deficits in APP/PS1 mice through inhibition of the amyloidogenic processing of APP[J].  Life Sciences， 2017，182：104-111.

[11]COSN-TOMS M， ANTONELL A， LLAD A， et al. Plasma miR-34a-5p and miR-545-3p as early biomarkers of Alzheimers disease： potential and limitations[J].  Molecular Neurobiology， 2017，54（7）：5550-5562.

[12]SARKAR S， JUN S， RELLICK S， et al. Expression of microRNA-34a in Alzheimers disease brain targets genes linked to synaptic plasticity，energy metabolism， and resting state network activity[J].  Brain Research， 2016，1646：139-151.

[13]WANG X Y， LIU P， ZHU H， et al. miR-34a， a microRNA up-regulated in a double transgenic mouse model of Alzheimers disease， inhibits bcl2 translation[J].  Brain Research Bulletin， 2009，80（4-5）：268-273.

[14]GUESSOUS F， ZHANG Y， KOFMAN A， et al. microRNA-34a is tumor suppressive in brain tumors and glioma stem cells[J].  Cell Cycle （Georgetown， Tex.）， 2010，9（6）：1031-1036.

[15]WANG X P， ZHOU J， HAN M， et al. MicroRNA-34a regulates liver regeneration and the development of liver cancer in rats by targeting Notch signaling pathway[J].  Oncotarget， 2017，8（8）：13264-13276.

（本文編辑 黄建乡）