MiR-371a-5p表达与非小细胞肺癌预后的关系

崔耀杰　金翔凤　刘玉洪

[摘要]目的探讨微小RNA-371a-5p（miR-371a-5p）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及临床意义。方法采用实时定量聚合酶链反应技术（RT-qPCR）检测136例NSCLC肿瘤组织和其癌旁正常组织（距离肿瘤5 cm以上）标本miR-371a-5p的表达，应用χ2检验分析miR-371a-5p表达与病人临床病理特征之间关系，Kaplan-Meier生存分析模型分析miR-371a-5p表达与NSCLC病人总生存期及无病生存期的相关性。采用单因素和多因素Cox模型分析miR-371a-5p对NSCLC病人预后预测价值。结果与癌旁正常组织相比，NSCLC肿瘤组织miR-371a-5p表达明显升高（t=12.515，P<0.01）。NSCLC病人miR-371a-5p高表达与肿瘤大小（χ2=4.960，P<0.05）、TNM分期（χ2=7.061，P<0.05）和淋巴结转移（χ2=10.675，P<0.01）显著相关。Kaplan-Meier生存分析显示，miR-371a-5p高表达组病人的总生存期低于miR-371a-5p低表达组（χ2=9.051，P<0.001）。单因素和多因素Cox分析表明，miR-371a-5p表达可作为NSCLC病人总生存期的独立预测指标（HR=1.8，95%CI=1.0～3.2，P<0.05）。结论MiR-371a-5p在NSCLC肿瘤组织中高表达并可以作为病人的预后生物标志物。

[关键词]癌，非小细胞肺;微RNAs;预后

[中图分类号]R734.2[文献标志码]A[文章编号]2096-5532（2021）01-0069-04

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of microRNA-371a-5p （miR-371a-5p） in non-small cell lung cancer （NSCLC）. MethodsReal-time quantitative PCR was used to measure the expression of miR-371a-5p in 136 NSCLC tissue samples and corresponding adjacent tissue samples （more than 5 cm away from the tumor）. The chi-square test was used to investigate the association between miR-371a-5p expression and clinical features， and the Kaplan-Meier survival analysis was used to analyze the correlation of miR-371a-5p expression with overall survival and disease-free survival of NSCLC patients. Univariate and multivariate Cox analyses were used to determine the value of miR-371a-5p in predicting the prognosis of NSCLC patients. ResultsCompared with the adjacent tissue samples， NSCLC tissue samples had a significant increase in the expression of miR-371a-5p （t=12.515，P<0.01）. The high expression of miR-371a-5p in NSCLC patients was significantly asso-ciated with tumor size （χ2=4.960，P<0.05）， TNM stage （χ2=7.061，P<0.05）， and lymph node metastasis （χ2=10.675，P<0.01）. The Kaplan-Meier survival analysis showed that the patients with high expression of miR-371a-5p had significantly lower overall survival than those with low expression of miR-371a-5p （χ2=9.051，P<0.01）. The univariate and multivariate Cox analyses showed that the expression of miR-371a-5p （HR=1.8，95%CI=1.0-3.2，P<0.05） could be used as an independent predictive factor for the overall survival of patients with NSCLC. ConclusionMiR-371a-5p is highly expressed in NSCLC tissue and can be used as a prognostic biomarker for NSCLC patients.

[KEY WORDS]carcinoma， non-small-cell lung; microRNAs; prognosis

肺癌是世界上最常見的恶性肿瘤之一，每年能导致160万人以上死亡[1]。肺癌主要分为两大类：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）[2]。其中，NSCLC占所有肺癌类型的80%以上[3]。对于早期肺癌临床治疗主要以手术为主，中晚期肺癌临床治疗主要以化疗或者化疗联合局部放射治疗为主，以控制肿瘤进展[4]。肺癌临床诊断较晚是其预后不良的主要原因[5-7]。与肺癌转移相关的生物标志物的研究对肺癌病人的预后监测具有重要意义。MicroRNA是由22～25个核苷酸组成的非编码RNA。目前，越来越多的研究结果表明，microRNA在肿瘤的发生和发展过程中起着重要的作用[8-10]。MiR-371a-5p作为一种重要的miRNA，在胰腺癌、子宫绒毛膜癌以及肝癌的发生、发展中发挥重要作用[11-13]。然而，miR-371a-5p在NSCLC中的作用尚不清楚。本文探讨miR-371a-5p表达在NSCLC病人中的预后价值。现将结果报告如下。

1资料和方法

1.1标本及其来源

从2014—2018年在我院行胸腔镜根治性或姑息性切除术的NSCLC病人中，选取136例NSCLC肿瘤组织和癌旁正常组织（距离肿瘤5 cm以上）标本。病人术前均未接受放疗或化疗等辅助治疗，无其他重大基础疾病（如糖尿病、冠心病等），并且经术后组织病理学检查、根据国际癌症联合会（UICC）第8版的术后病理分期标准确诊为NSCLC。病人的肿瘤组织及正常组织使用RNA保护液固定并保存于-80 ℃冰箱中。从医院病历系统中检索病人的临床资料。以诊断之日起至最后一次随访或与癌症相关的死亡时间计为病人的总生存期;以诊断之日至肿瘤复发时间计为病人的无病生存期。所有病人的最终随访时间均为2019年10月。

1.2实时定量荧光PCR（RT-qPCR）法检测miR-371a-5p表达

于-80 ℃冰箱中取出预先保存的肿瘤组织标本和正常组织标本，应用TRIzol试剂提取总RNA，核酸蛋白定量仪测定吸光度（A）值，A260/A280值为1.8～2.0表明样本纯度符合要求。使用First-Strand cDNA Synthesis试剂盒将总RNA反转录为互补DNA（cDNA）。反应条件为：42 ℃、2 min，37 ℃、15 min， 85 ℃、5 s。取cDNA 2 μL和SYBR Green PCR Master Mix 18 μL用于RT-qPCR。反应条件为：预变性 95 ℃、2 min;然后 95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，72 ℃、5 min，共进行40个循环。以U6作为内参基因。应用2-ΔΔCt法计算miR-371a-5p的相对表达水平。 MiR-371a-5p以及U6引物购于上海市吉玛基因生物科技有限公司，RNA反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。RT-qPCR引物及其序列见表1。

1.3统计学方法

应用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料结果以±s表示，数据间比较采用t检验;计数资料比较采用卡方检验;使用对数秩检验对Kaplan-Meier生存曲线进行统计学检验;使用单因素和多因素Cox比例风险模型分析影响病人预后的危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1NSCLC肿瘤组织和癌旁正常组织miR-371a-5p 表达比较

NSCLC肿瘤组织miR-371a-5p表达为1.82±0.67，正常组织为0.76±0.38，两组比较差异有显著性（t=12.515，P<0.01）。

2.2MiR-371a-5p表达与NSCLC病人临床病理特征的关系

根据NSCLC肿瘤组织中miR-371a-5p表达的中位数，将136例病人分为高表达组（2-ΔΔCt值≥0.903 3）和低表达组（2-ΔΔCt值<0.903 3）。NSCLC组织miR-371a-5p高表达与肿瘤大小（χ2=4.960，P<0.05）、TNM分期（χ2=7.061，P<0.05）和淋巴结转移（χ2=10.675，P<0.01）等相关。见表2。

2.3MiR-371a-5p表达与NSCLC病人预后相关性

MiR-371a-5p高表达组NSCLC病人的中位总生存期为2.33年（95%CI=0.41～4.44），中位无病生存期为1.59年（95%CI=0.32～4.32）;miR-371a-5p低表达组病人的中位总生存期为2.78年（95%CI=0.22～4.79），中位无病生存期为2.27年（95%CI=0.21～4.78）。Kaplan-Meier生存分析显示， miR-371a-5p高表达组NSCLC病人的总生存期显著高于低表达组（χ2=9.051，P<0.003），但是两组之间无病生存期比较差异无显著性（χ2=0.821，P>0.05）。见图1。单因素Cox分析显示，淋巴结转移（HR=4.5，95%CI=2.4～8.5，P<0.01）、远处转移（HR=2.2，95%CI=1.0～4.6，P<0.05）、TNM分期（HR=2.2，95%CI=1.2～3.8，P<0.01）和miR-371a-5p表達（HR=2.3，95%CI=1.3～3.9，P<0.01）与NSCLC病人的总生存期显著相关。见表3。以单因素Cox分析中有统计学意义的变量作为自变量进行多因素Cox分析，结果显示，淋巴结转移（HR=4.0，95%CI=2.1～7.7，P<0.01）和miR-371a-5p表达（HR=1.8，95%CI=1.0～3.2，P<0.05）是NSCLC病人总生存期的独立预测指标。见表4。

3讨论

在美国，癌症5年总体存活率在60%左右，但肺癌的5年存活率只有18%[14]。大多数的肺癌在初次诊断时即为局部晚期甚至存在远处转移，这也是肺癌总体预后不良的重要原因之一[15]。寻找新的治疗标靶或新的生物标志物，对于提高肺癌病人的生存率以及改善预后具有非常重要的意义。

MiR-371a-5p作为一种重要的miRNA与多种癌症密切相关。MiR-371a-5p在胰腺癌组织通过与TUSC7结合抑制其抑癌作用从而导致胰腺癌的发生、发展[11]。有研究表明，miR-371a-5p可直接靶向BCCIP的3′-UTR区并参与调节子宫绒毛膜癌组织中与肿瘤转移相关的多条途径，进一步激活了绒毛膜癌转移的下游通路，导致绒毛膜癌细胞转移的发生[12]。MiR-371a-5p表达上调在乙型肝炎相关肝癌中起重要作用，其表达与HBV和睾丸激素呈正相关。HBV和睾丸激素可通过LEF-1/miR-371a-5p/SRCIN1/PTN/Slug途径，促进肝癌细胞的增殖和转移[13]。这些研究结果表明，miR-371a-5p在多种癌症的发生、发展和转移中起重要作用，但miR-371a-5p在NSCLC中的作用仍不清楚。

本文RT-qPCR检测结果显示，与癌旁正常组织相比，NSCLC肿瘤组织中miR-371a-5p的表达明显上调;miR-371a-5p表达与NSCLC的肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移密切相关，提示miR-371a-5p可以用作预后监测的潜在生物标志物。本文单因素和多因素Cox分析结果显示，miR-371a-5p表达是NSCLC病人总生存期的独立预测指标。此外，Kaplan-Meier分析显示，miR-371a-5p高表达病人总体生存率较低，提示miR-371a-5p在NSCLC中可能发挥着癌基因的作用。由于本文研究样本数量有限，且为单中心研究，无法充分控制混杂因素的影响，因此miR-371a-5p在NSCLC发展和转移中的分子机制仍有待进一步研究。

综上所述，miR-371a-5p在NSCLC肿瘤组织中表达上调并与病人不良预后相关，miR-371a-5p可以作为一种潜在的监测NSCLC病人预后的生物标志物。

[参考文献]

[1]American Lung Association. Lung cancer key findings[R].  https：//www.lung.org/research/state-of-lung-cancer/key-findings.

[2]SIEGEL R L， MILLER K D， JEMAL A. Cancer statistics， 2016[J].  CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2016，66（1）：7-30.

[3]American Cancer Society. Key statistics for lung cancer[R].  https：//www.cancer.org/cancer/lung-cancer/about/key-statistics.html.

[4]MOLINA J R， YANG P， CASSIVI S D，  et al.  Non-small cell lung cancer： epidemiology， risk factors， treatment， and survivorship[J].  Mayo Clinic Proceedings， 2008，83（5）：584-594.

[5]NAKAMURA H， KAWASAKI N， HAGIWARA M，  et al.  Early hilar lung cancer： risk for multiple lung cancers and cli-nical outcome[J].  Lung Cancer （Amsterdam， Netherlands）， 2001，33（1）：51-57.

[6]WOOLNER L B， FONTANA R S， CORTESE D A，  et al.  Roentgenographically occult lung cancer：pathologic findings and frequency of multicentricity during a 10-year period[J]. Mayo Clinic Proceedings， 1984，59（7）：453-466.

[7]FUJIMURA S， SAKURADA A， SAGAWA M， et al. A the-rapeutic approach to roentgenographically occult squamous cell carcinoma of the lung[J].  Cancer， 2000，89（11 Suppl）：2445-2448.

[8]ZHANG B H， PAN X P， COBB G P，  et al. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors[J].  Developmental Biology， 2007，302（1）：1-12.

[9]GARZON R， MARCUCCI G， CROCE C M. Targeting microRNAs in cancer：rationale， strategies and challenges[J].  Nature Reviews Drug Discovery， 2010，9（10）：775-789.

[10]HAYES J， PERUZZI P P， LAWLER S. MicroRNAs in can-cer： biomarkers， functions and therapy[J].  Trends in Molecular Medicine， 2014，20（8）：460-469.

[11]YUE L， GUO J. LncRNA TUSC7 suppresses pancreatic carcinoma progression by modulating miR-371a-5p expression[J]. Journal of Cellular Physiology， 2019. doi：10.1002/jcp.28248.

[12]ZHAO J R， CHENG W W， WANG Y X，  et al.  Identification of microRNA signature in the progression of gestational tro-phoblastic disease[J].  Cell Death & Disease， 2018，9（2）：94.

[13]BAI P S， HOU P， KONG Y. Hepatitis B virus promotes proliferation and metastasis in male Chinese hepatocellular carcinoma patients through the LEF-1/miR-371a-5p/SRCIN1/pleiotrophin/Slug pathway[J].  Experimental Cell Research， 2018，370（1）：174-188.

[14]SIEGEL R L， MILLER K D， JEMAL A. Cancer statistics， 2018[J].  CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2018，68（1）：7-30.

[15]DA CUNHA SANTOS G， SHEPHERD F A， TSAO M S. EGFR mutations and lung cancer[J].  Annual Review of Pathology： Mechanisms of Disease， 2011，6（1）：49-69.

（本文編辑 黄建乡）