小建中汤对脾虚泄泻幼鼠肠粘膜免疫功能影响的研究

王静，冉志玲，杜渊，王新雪

（1.西南医科大学中西医结合学院，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000）

0 引言

腹泻病是我国儿科关注的重点，是五岁以下儿童死亡的常见原因之一。急性腹泻在儿童腹泻病诊断治疗指南推出以后诊疗得到了规范，治疗水平得到极大提高，急性腹泻的死亡率已大大降低[1]，而慢性腹泻病程长，病因复杂、治疗方式局限，疗效欠佳，常伴有营养物质吸收障碍，并导致营养不良、生长发育障碍、免疫功能低下及反复感染等，严重影响儿童体格与智力发育，因此我们建议应该加强对慢性腹泻的研究。从中医来讲，慢性腹泻属于中医“久泄”范畴，脾虚是该病发生的关键环节，也是腹泻迁延不愈，反复发作的主要因素。我院儿科基于《黄帝内经》“甘生脾”理论，临床上运用小建中汤治疗小儿脾虚泄泻疗效好。为探索小建中汤是否能通过提高肠道局部粘膜免疫功能从而达到治疗脾虚泄泻的目的，本研究通过观察幼鼠的一般情况、胸腺指数、脾指数，同时采用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测肠粘膜分泌型免疫球蛋白（SlgA）、IL-2、IL-4的水平变化，以期为小建中汤治疗脾虚泄泻提供可能的实验依据。现将研究结果报道如下：

1 实验方案

1.1 动物

昆明幼年雄性小鼠48只，体重20.55±1.13g，动物由西南医科大学实验动物中心提供（SCXK（川）2018-17）。

1.2 药物及试剂

中药煎液：采用目前较为公认的柯氏观点（根据汉代出土文物中衡器与量器换算的结论）[2]，东汉1升≈ 200毫升（今），1两≈15.62g（今）计算东汉时期小建中汤原方剂量约为：饴糖 150g（生产许可证号 SC11332040400877）、桂枝 45g、芍药90g、生姜45g、大枣45g、炙甘草30g,根据人与动物剂量折算表[3]换算出相应的幼鼠用药剂量，将其制成生药浓度约2.63g/mL 的浓缩液150mL，设定为小建中汤高剂量；小建中汤现代方剂学教材推荐剂量参考第九版方剂学教材[4]为饴糖 30g、桂枝 9g、芍药 18g、炙甘草 6g、生姜 9g、大枣 9g、制成生药浓度为0.52g/mL的水煎液150mL，设定为小建中汤低剂量；生大黄水煎液: 大黄300g，制成生药浓度为1g/mL药液300mL。上述中药水煎液完成后均保存于4℃冰箱。以上药材（除饴糖外）由西南医科大学附属中医医院中药房提供，中药煎剂由西南医科大学附属中医医院制剂室协助完成。

试剂：小鼠分泌型免疫球蛋白A（SlgA）elisa试剂盒、小鼠白介素4（IL-4）、白介素2（IL-2）elisa试剂盒均购自睿信生物。

1.3 分组及造模

将48只幼鼠随机分为2组，正常组（A组）12只，造模组36只，采用生大黄水煎液复制脾虚泄泻幼鼠模型。每天给予A组幼鼠生理盐水0.2mL/10g灌胃，每天一次。其余幼鼠均灌服生大黄水煎液0.2mL/10g，每天一次，连续7天造模。参考北京师范大学脾虚动物造模成功的标准[5]及脾气虚证模型诊断标准[6]，认为本研究幼鼠出现大便不成型，食少纳呆，体重增长减慢或减轻，神态萎靡，毛色无光泽、枯槁或疏散或竖立，蜷缩聚堆、抓取时挣扎无力症状，即可认为脾虚泄泻造模成功。于第8天将造模成功的幼鼠再随机分为3组，脾虚泄泻组（B组）、小建中汤高剂量组（C组）、小建中汤低剂量组（D组）。

1.4 给药方法

第8天，对C组予以小建中汤高剂量（2.63g/mL）药液灌胃治疗，对D组进行小建中汤低剂量（0.52g/mL）药液灌胃治疗，每只0.2mL/10g，每天一次，连续灌药10d。A组和B组予生理盐水灌胃，每只0.2mL/10g，每天一次，连续10d。

1.5 标本采集

于第18天麻醉后（苯巴比妥钠50mg/kg腹腔注射）采用颈椎脱臼法处死各组幼鼠，取幽门下小肠组织20cm置于标本冻存管内，迅速放于液氮中速冻，然后转移至-80°冰箱保存备用，解剖后称重幼鼠的胸腺和脾脏。

1.6 观察指标

（1）一般情况：观察每日幼鼠的精神、饮食、皮毛光泽、运动、体重、大便性状情况。

（2）胸腺指数：称量幼鼠的体重和胸腺，计算胸腺指数=胸腺重量(mg)/体重(g)。

（3）脾指数：称量幼鼠的体重和脾脏，计算脾指数=脾脏重量(mg)/体重(g)。

（4）肠粘膜组织slgA含量测定：取幽门下20cm小肠组织，平铺于无菌培养皿中，纵向剪开，放入装有8mLPBS溶液的离心管中，涡旋15s，3000rpm离心20min，收集上清液，按照幼鼠slgAelisa试剂盒严格进行操作。

（5）肠粘膜组织IL-2、IL-4浓度测定：取上述小肠组织上清液，按照幼鼠白介素4（IL-4）、白介素2（IL-2）elisa试剂盒进行操作。

1.7 统计方法

采用SPSS 17.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。先进行正态检验及方差齐性检验，对两组间比较采用独立样本T检验，对多组间比较采用单因素方差分析，多样本间的两两比较采用LSD-t 检验。

2 结果

2.1 造模后幼鼠的一般情况

实验前正常组和造模组的幼鼠活跃、皮毛柔顺整洁有光泽、饮食可、大便正常、抓取时挣扎有力，且实验前两组幼鼠体重比较无差异性（P=0.689＞0.05）。造模7d结束，第8天时造模组幼鼠的表现为大便不正常（不成型，肛门周围皮毛污秽或稀软便等），毛发竖立、疏散、少光泽、神态萎靡、眯眼、食少、聚堆、灌胃抓取时挣扎无力等表现，且造模组的幼鼠体重较正常幼鼠显著增长缓慢（P＜0.05）（由表1可知），提示造模成功。

表1 造模前后幼鼠的体重变化（±s）

表1 造模前后幼鼠的体重变化（±s）

注：数据均为正态分布，具有方差齐性，故采用独立样本T检验；P＜0.05,表明组间具有差异性

组别 造模前（g） 造模后（g）正常组（n=12） 20.667±1.285 26.242±2.341造模组（n=36） 20.514±1.089 21.919±2.126 T 0.402 5.950 P 0.689 0.000

2.2 小建中汤对脾虚泄泻幼鼠一般情况及体重的影响

予以小建中汤干预后，脾虚泄泻幼鼠逐渐精神好转，饮食增加，皮毛光泽整洁，大便由不成型便到软便、正常便，逐渐活跃好动，挣扎、有力，提示脾虚症状逐渐恢复。由表2可知，给药前，正常组幼鼠的体重显著高于其余三组造模成功的幼鼠（P＜0.05)，且B、C、D三组幼鼠给药前的体重没有差异性（P＞0.05）。经予以小建中汤干预后，C、D组的幼鼠体重出现明显增长，均显著高于B组（脾虚泄泻组）（P＜0.05），且与正常幼鼠的体重无差异性（P＞0.05）。表明，小建中汤有促进脾虚泄泻幼鼠体重增长的作用。

表2 小建中汤对幼鼠的体重影响（±s）

表2 小建中汤对幼鼠的体重影响（±s）

注：*，表示与A组进行对比，P＜0.05；#，表示与B组比较，P＜0.05

组别 给药前（g） 给药后（g）A组(正常组) 26.242±2.341 28.975±1.622#B组（脾虚泄泻组） 21.825±2.362* 25.892±3.290*C组（小建中汤高剂量组） 22.017±2.412* 30.108±3.098#D组（小建中汤低剂量组） 21.917±1.723* 28.375±2.845#齐性检验 0.764(P=0.521) 2.110(P=0.113)F 11.314 4.894 P 0.000 0.005

2.3 小建中汤对脾虚泄泻幼鼠胸腺指数及脾指数的影响

由表3可知，脾虚泄泻幼鼠的胸腺指数和脾指数明显低于正常组幼鼠（P＜0.05）。对脾虚泄泻幼鼠予以小建中汤干预后，C、D两组的胸腺指数较脾虚泄泻组均了出现显著性增长（P＜0.05）。C组的脾指数增长显著，D组的脾指数增加无显著统计学意义（P＞0.05）。从数据结果来看，C和D组的胸腺和脾指数均高于B组（脾虚泄泻组），同时接近于A组（正常组）。说明，小建中汤有提高脾虚泄泻幼鼠胸腺指数和脾指数水平的作用。

表3 小建中汤干预对幼鼠胸腺指数和脾指数的影响（±s）

表3 小建中汤干预对幼鼠胸腺指数和脾指数的影响（±s）

注：#,表示与B组进行对比，P＜0.05

组别 脾指数（mg/g） 胸腺指数（mg/g）A组（正常组） 6.446±1.819# 2.299±0.601#B组（脾虚泄泻组） 4.540 ±1.754 1.526±0.461 C组（小建中汤高剂量组） 6.191±1.688# 2.304±0.536#D组（小建中汤低剂量组） 5.718±1.686 2.008±0.401#齐性检验 0.069(P=0.976) 1.265(P=0.298)F 2.835 6.295 P 0.049 0.001

2.4 小建中汤对脾虚泄泻幼鼠肠粘膜slgA的作用

由表4可知，脾虚泄泻幼鼠肠粘膜分泌SlgA的水平较正常组幼鼠出现显著性下降（P＜0.05）。经予以小建中汤干预后，C组和D组幼鼠肠粘膜分泌的SlgA水平，较B组（脾虚泄泻组）明显升高（P＜0.05），且C组幼鼠分泌SlgA的水平高于D组（P＜0.05）。表明小建中汤可以促进脾虚泄泻幼鼠肠粘膜分泌SlgA，且小建中汤高剂量提高脾虚泄泻幼鼠SlgA水平的作用优于小建中汤低剂量组。

2.5 小建中汤对脾虚泄泻幼鼠小肠粘膜组织IL-2、IL-4含量的影响

由表4可知，与正常幼鼠相比，脾虚泄泻幼鼠小肠组织分泌的 IL-2水平下降（P＜0.05），而 IL-4水平升高（P＜0.05）；与脾虚泄泻组比较，小建中汤干预后，C组和D组幼鼠的IL-2水平显著性上升（P＜0.05），C组的IL-2水平高于D组,但不显著（P=0.056）。而小建中汤干预后C、D组IL-4水平均有下降，但C组IL-4水平下降更显著（P＜0.05），而D组IL-4水平降低无显著意义（P＞0.05）。说明，小建中汤可以上调小肠粘膜组织中IL-2的水平，而降低IL-4的水平，且小建中汤高剂量组对IL-2、IL-4的调节作用更明显。

表4 小建中汤对脾虚泄泻幼鼠小肠粘膜SlgA、IL-2、IL-4的影响（±s）

表4 小建中汤对脾虚泄泻幼鼠小肠粘膜SlgA、IL-2、IL-4的影响（±s）

注：表示与B组进行对比，#，P＜0.05；表示D组进行比较，※,P＜0.05

组别 slgA（μg/mL） IL-2（pg/mL） IL-4（pg/mL）A组（正常组） 24.463±2.315# 158.746±30.522# 130.938±16.594#B组（脾虚泄泻组） 18.441±2.856 103.121±21.108 168.703±17.098 C组（小建中汤高剂量组） 27.570±2.658#※ 181.261±22.798# 153.185±17.656#D组（小建中汤低剂量） 25.423±2.520# 161.04±25.597# 162.066±11.699齐性检验 0.401(P=0.753) 1.010(P=0.397) 1.042(P=0.384)F 27.265 21.122 12.807 P 0.000 0.000 0.000

3 讨论

小儿素体脾弱，运化功能尚未臻全，加之后天调护失宜，罹患他病或久病迁延不愈，进一步损伤脾胃，致脾弱不健运，胃虚不腐熟，水谷不化，精微不布，精华糟粕不分，合污而下，混走大肠，从而发生脾虚泄泻。小儿脾虚泄泻以病程长，迁延不愈为特点，精微不能输化，气血化生乏源，不足以濡养脏腑肌肤，易生疳证；久泄致土虚木旺，内风从生，可成慢惊风；土虚不生金，皮肤毛窍不荣，腠理不密，正气亏虚，易为外邪所害，故患儿容易反复感冒；脾虚泄泻，所生疳证、慢惊风、反复感冒与今慢性腹泻易合并营养不良、反复呼吸道感染、惊厥具有高度的一致性，因此，脾虚是慢性腹泻的主证，小儿脾虚泄泻是儿科医生们高度重视的疾病之一。

脾虚泄泻者，脾不健运，水谷精微不化，气血不充，形神失养，则神疲、倦怠、发力；脾胃升降失职，脾不升则精微物质不能输布，无以营养皮毛，则出现皮肤毛发枯燥、少华；胃不降则受纳腐熟失常，不思饮食，则出现体重减轻、体重不增或增长减慢。脾虚致泄者，先损脾气、再伤脾阳，不能发挥温煦作用，则畏寒怯冷。本实验结果显示脾虚泄泻造模后的幼鼠，出现大便溏泄、体重增长缓慢、食少，神态萎靡，毛色欠光泽、竖立，蜷缩聚堆、抓取时挣扎无力症状，符合脾虚泄泻模型标准。

现代大量的研究证实脾虚泄泻与人体免疫功能紊乱关系密切。胸腺是人体重要的中枢性免疫器管，通过分泌多种细胞因子和胸腺激素，促进胸腺细胞（处于不同阶段的T细胞）分化、发育、成熟，主要参与细胞免疫，辅助体液免疫，同时也是机体固有免疫（γδT细胞）的组成部分。脾脏是机体最大的外周免疫器管，含有大量的B细胞、部分T细胞和少量巨噬细胞，主要参与体液免疫、细胞免疫，对非特异性免疫有辅助作用。器官的重量一定程度上可以反映免疫细胞的数量。本实验结果显示造模成功的脾虚泄泻幼鼠胸腺及脾脏指数较正常幼鼠下降，可以初步提示脾虚泄泻幼鼠免疫功能下降，但予以小建中汤药液干预后，脾脏及胸腺指数均有上升，说明小建中汤对免疫功能有改善作用。

肠道局部免疫功能下降，被认为是脾虚泄泻迁延不愈的主要原因[7]。正常情况时 ,肠粘膜相关淋巴组织中含有大量的B细胞 ,其中 70 %至 90 %是分泌 IgA的[8]。分泌型IgA（SlgA）是肠粘膜的主要免疫球蛋白，可阻止细菌粘附定植于肠道粘膜表面，还可中和肠道内病毒与病菌的毒素作用，同时可以与补体及溶酶体共同作用溶解细菌，是肠粘膜发挥抗感染免疫防御的关键因子，被称为是肠粘膜免疫的核心[9]。有大量的实验发现在脾虚泄泻肠粘膜分泌SlgA的量会下降[10-12]。本研究发现大黄致脾虚泄泻幼鼠小肠粘膜分泌的SlgA含量较正常幼鼠减少，符合目前已有的研究结论。与脾虚泄泻幼鼠相比，小建中汤可以上调肠粘膜对SlgA的分泌，东汉时期仲景原方剂量对SlgA产生的促进作用优于现代方剂学教材推荐的剂量。

辅助性T细胞（Th细胞），是辅助T、B细胞参与免疫反应的亚群。Th1和Th2细胞是相互调节、相互抑制的，二者的平衡失调与多种疾病的发生相关。IL-2、IL-4分别代表Th1细胞和Th2细胞，介导细胞免疫和体液免疫。有实验证实，脾虚泄泻大鼠较正常大鼠相比血清IL-2下降，而IL-4升高[13]。相反，也有学者通过大黄苦寒泻下法建立脾虚模型，发现脾虚小鼠血清IL-2、IL-4均较正常鼠下降[14]。本实验发现大黄致脾虚泄泻幼鼠的肠粘膜组织中IL2、IL-4含量与正常幼鼠比较，IL-2下降，而IL-4上升，这可能与Th2细胞分泌的IL-4会抑制Th1细胞的分化和增值，从而使Th1细胞分泌IL-2减少有关。提示脾虚泄泻时Th0（未完全分化的Th细胞）向Th2分化增多，破坏Th1和Th2的平衡关系。经小建中汤干预后，脾虚泄泻幼鼠小肠粘膜组织分泌的IL-2水平升高，而IL-4的水平会下降。说明小建中汤可以通过促使脾虚泄泻幼鼠的小肠粘膜组织分泌IL-2而抑制IL-4的产生，使脾虚泄泻状态Th0分化Th1细胞占优势，重新调节Th1和Th2的比例来改善肠道免疫功能，改善脾虚症候的作用。同时东汉时期仲景小建中汤原方剂量和现代方剂学推荐剂量相比，仲景原方剂量对脾虚泄泻Th1和Th2的这种调节作用要优于现代教材推荐的剂量。

小建中汤可以改善肠道局部粘膜免疫功能，中医学认为小建中汤关键的作用在于甘温补脾建中。久泻、虚泻者，先损脾气，继损脾阳，脾气亏虚，水湿不化，困阻脾阳，脾阳不振，中阳不举，则泄泻迁延难愈。治疗要点，重在补益脾气，使脾运复健，脾阳振奋，则水湿得以温化。根据《黄帝内经》中记载“土生甘，甘生脾”“五味入胃，.甘先入脾..”，认为甘味生于谷,谷是土之所生,甘为土之味也，味甘者，最能补人以脾气，故临床上我们采用甘味汤剂小建中汤治疗脾虚泄泻能获得满意效果。小建中汤为甘温补脾建中的代表方剂，方中重用甘温质润者，胶饴（又名饴糖）为君，以甘润建土，《本草纲目》称其为“补虚冷，益气力..健脾胃，补中”。桂枝味辛、甘，性温，走而不守，《本草纲目》日：“桂枝透达营卫，脾主营，肺主卫，甘走脾，辛走肺也”，桂枝合甘润胶饴配伍，可入脾经，温通脾阳，振奋中气，复脾运之职，同时防饴糖滋腻之性碍脾。芍药，味苦，酸，性微寒。《医学启源》称其可安脾经，收胃气，止泻痢，和血脉，固腠理。合君药以酸甘化阴，以复失之津，且有敛气止泻、柔肝扶土之功。生姜、大枣、草可助君药补脾健胃，化生气血，充养五脏六腑。诸药相配伍，有温中健脾止泻之力，同时有燮理阴阳、补益气血、固实腠理、柔肝缓急之功，可治脾虚泄泻继发疳证、慢惊风、反复感冒等，故谓之乃脾虚泄泻之妙方也。本方以建立中气为本，中气立，脾胃复其升降，脾健运且升清，而胃腐熟且通降，可以改善脾虚本质，从而可以提高脾虚泄泻幼鼠的肠道粘膜免疫功能的作用。

综上，小建中汤可以上调脾虚泄泻幼鼠胸腺指数、脾指数、小肠粘膜组织的slgA、IL-2，下调IL-4水平，来调节肠道粘膜免疫功能，改善脾虚本质，这可能是治疗脾虚泄泻的机制之一，且仲景原方剂量对改善肠粘膜免疫功能的作用优于现代方剂学教材推荐剂量。小建中汤治疗脾虚泄泻值得推广，且经方配伍及剂量应该得广泛的重视。