枸杞多糖促进慢性溃疡性结肠炎活动期小鼠结肠组织T re k1的表达

王 芳，王鹓臻，吴 佳，李亚俊

（宁夏医科大学总医院消化内科，银川 750004）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种肠道特发性炎症性疾病，可引起结肠持续的黏膜炎症，其活动期具有典型的症状，如腹泻、腹痛、黏液脓血便和体质量减轻[1-2]。研究表明，枸杞多糖（lyciumbarbarum polysaccharide，LBP）具有广泛的生物学特性，包括抗氧化、免疫调节以及肠道菌群的调控作用，对结肠炎的肠道症状具有一定的治疗作用[3-4]。Trek1（TWIK-Related K+Channel 1）是双孔结构域（K2P）机械门控钾通道，在结肠上皮细胞和平滑肌中特异性表达，维持肠上皮屏障完整性并参与肠道收缩的调节[5-7]。LBP能否通过调控结肠组织中Trek1的表达改善UC活动期症状尚不明确。本实验通过研究LBP对慢性UC模型鼠活动期症状的改变以及Trek1 mRNA和蛋白表达的影响，以期为LBP缓解活动期慢性UC的机制研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 试剂及仪器

葡聚糖硫酸酯钠盐（DSS）（MP生物医学公司）；LBP（百瑞源，含量≥50%）；联苯胺（艾科试剂）；总RNA提取试剂盒、总蛋白提取试剂盒（上海朗顿生物科技有限公司）；逆转录试剂盒、qPCR试剂盒（赛默飞世尔公司）；荧光定量PCR仪（赛默飞世尔公司）；兔抗Trek1/β-actin抗体、HRP-山羊抗兔抗体（Abcam公司）。

1.2 各组小鼠模型的制备

18只6～8周C57BL/6小鼠，体质量20 g左右，SPF级，随机分为正常组、造模组和治疗组，每组6只。正常组小鼠饮用dH2O 25 d，无特殊处理；造模组和治疗组小鼠第1～5、第11～15、第21～25天饮用2%的DSS，制备慢性UC小鼠模型并模拟慢性UC活动期；治疗组小鼠从第6天开始，每天给予200 mg·（kg·d）-1的LBP灌胃。各组小鼠第0、5、10、15、20、25天时测量体质量、评估肛周及收集粪便情况。造模组和治疗组小鼠第5天体质量和疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分与正常组比较差异有统计学意义，则提示小鼠模型制备成功。

1.3 DAI评分

各组小鼠于第0、5、10、15、20、25天时监测体质量、腹泻及便血情况，并计算DAI评分。体质量：相较于正常组小鼠体质量，造模组和治疗组小鼠体质量变化＜1%（0分），1%～5%（1分），5%～10%（2分），10%～20%（3分），＞20%（4分）。小鼠大便性状：正常便（0分），干燥小粒状；半稀便（2分），糊状便但不粘肛门；稀便（4分），液状便并粘肛门。大便隐血：阴性（0分），阳性（2分），肉眼血便（4分）。三项评分之和即为DAI评分。小鼠UC病情越重，则DAI评分越高。

1.4 大便隐血的检测

采用联苯胺冰醋酸法，在收集好的粪便上先后各滴加2滴联苯胺冰醋酸液和过氧化氢后，观察粪便颜色变化，2 min内变为蓝色则为阳性，未变色则记为阴性，明显大便带血和肛门处血迹评定为肉眼血便。

1.5 结肠组织的分离和总RNA、总蛋白的提取

于实验第26日清晨采用断颈法处死小鼠后取小鼠结肠组织，剪碎后按说明书（总RNA提取试剂盒、总蛋白提取试剂盒）步骤提取总RNA、总蛋白，然后采用BCA定量试剂盒进行总蛋白定量，最后-80℃保存备用。

1.6 实时荧光定量PCR检测Trek1 mRNA的相对表达量

Trek1引物序列：上游序列5'-ACAGAACTTC ATAGCCCAGCAT-3'，下游序列：5'-TCCCACCTCTTCCTTCGTCT-3'，Tm 57℃；β-actin引物序列：上游序列5'-AGCGAGCATCCCCCAAAG-3'，下游序列5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'，Tm 59℃。按照逆转录试剂盒说明书，用5X All-In-One RT MasterMix（100×20 plrxns）逆转录试剂盒合成Trek1的cDNA。在荧光定量PCR仪中进行定量实时PCR。使用β-actin作为内源参考基因。按照qPCR试剂盒说明书进行Trek1基因的变性、复性、延伸循环。然后计算2-ΔΔCt值，进行Trek1的定量实时PCR分析。

1.7 Western blot检测Trek1蛋白相对表达量

将提取的总蛋白进行电泳、蛋白质转移，在5%脱脂奶粉中封闭1 h后，一抗杂交（兔抗Trek1抗体1∶1000中4℃孵育过夜），漂洗后二抗杂交（HRP-山羊抗兔抗体1∶5000室温下孵育1 h），漂洗后ECL工作液温孵育转印膜1 min，显影、定影，采用BandScan 5.0软件分析条带的光密度值，每组实验重复3次。Trek1蛋白相对表达量=（Trek1 OD值/β-actin OD值）×10。

1.8 统计学方法

数据运用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）进行描述，组间比较采用方差分析及LSD-t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LBP增加慢性UC小鼠的体质量

实验第5、10、15、20、25天，慢性UC小鼠（造模组）体质量均轻于正常组（P均＜0.001），提示慢性UC小鼠模型制备成功；实验第15、20、25天，治疗组小鼠体质量较造模组增加（P均＜0.05），见图1。

图1 LBP对慢性UC小鼠体质量的影响

2.2 LBP降低慢性UC小鼠的DAI评分

实验第5、10、15、20、25天，慢性UC小鼠（造模组）DAI评分均高于正常组（P均＜0.001）。实验第10、15、20、25天，治疗组小鼠体质量、腹泻及肉眼血便情况较造模组明显减轻，DAI评分均低于造模组（P均＜0.05），见图2。

图2 LBP对慢性UC小鼠DAI评分的影响

2.3 LBP增加慢性UC小鼠结肠组织的Trek1 mRNA和蛋白的相对表达量

造模组小鼠结肠组织Trek1 mRNA相对表达量（0.182±0.04）低于正常组（0.928±0.24），治疗组Trek1 mRNA相对表达量（0.762±0.037）高于造模组（P均＜0.001），见图3。造模组小鼠结肠组织Trek1蛋白相对表达量（1.33±0.18）低于正常组（9.42±0.36），治疗组Trek1蛋白相对表达量（7.22±0.12）高于造模组（P均＜0.001），见图4。

图3 RT-qPCR检测LBP对慢性UC小鼠Trek1mRNA相对表达的影响

图4 Western blot检测LBP对慢性UC小鼠Trek1蛋白表达的影响

3 讨论

LBP是枸杞中提取的主要活性成分，具有调节免疫、调节血糖血脂、抗肿瘤、抗衰老等作用，目前在炎症损伤的治疗中应用广泛[8-13]。LBP的抗炎作用已在多种疾病中被证实，如通过抑制炎性反应，对小鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用；能有效减轻胶原诱导的类风湿关节炎模型骨损伤和骨丢失，同时减轻Ⅱ型胶原诱导的关节炎小鼠炎性反应；能够减轻IL-1β诱发的ATDC 5细胞（小鼠软骨细胞）的炎性损伤[8-9，12]。本研究通过2%DSS制备慢性UC活动期小鼠模型，200 mg·（kg·d）-1的LBP灌胃治疗模型鼠，发现LBP能够改善慢性UC的肠道炎症损伤所引起的小鼠体质量减轻、腹泻和便血的典型症状，提示LBP能够改善肠道炎症所造成的结肠组织的损伤，为LBP改善全身炎性反应、缓解炎性反应造成的不同器官损伤提供更多的支持。

目前仍不清楚UC的发病原因和机制，但其被认为与基因、肠道菌群以及外部环境所导致的机体自身免疫失衡进而引起的肠道炎性反应密切相关[1]。目前治疗策略主要通过5-氨基水杨酸等免疫抑制药物、糖皮质激素、英夫利昔单抗等局部或全身用药，以抑制炎性反应，减轻肠道损伤[14]。本研究发现，LBP能够减轻肠道的炎症损伤，并能够促进肠壁内Trek1的表达。

Trek1是钾离子通道，目前已发现其对器官功能的维持及器官上皮细胞稳定性具有调节作用。例如，Trek1可调节肺泡上皮细胞的牵张诱导脱离；过敏性鼻炎患者和大鼠的高通透性鼻黏膜中Trek1的表达较低，且炎症因子IL-4可抑制Trek1的表达；Trek1离子通道参与细胞膜机械敏感性的调节，该离子通道对于怀孕期间子宫稳定性的维持起到至关重要的作用[15-16]。本研究发现，LBP对Trek1蛋白与其mRNA表达调节趋势一致，即LBP可促进活动期溃结模型鼠结肠中Trek1的表达，改善溃结症状，结合Trek1具有调节上皮细胞稳定性的功能，推断LBP缓解溃结症状，可能与其通过调节肠上皮中Trek1的表达从而改善肠黏膜屏障功能有关，该改善作用仍需要进一步研究，才能明确LBP对溃结小鼠结肠上的炎性反应、Trek1的表达以及肠黏膜屏障功能的调节作用，从而为LBP缓解活动期慢性UC的机制研究及实际应用奠定基础。