门静脉高压症标本库的初步建立、质控及管理

赵肖灵，王继涛，张小冲，张二鹏，李金龙，陈威，张昆鹏，张博，陈欣欣，刘登湘

（河北医科大学附属邢台市人民医院 门脉高压研究中心，河北 邢台 054001）

门静脉高压症（portal hypertension，PH）是影响肝硬化患者临床预后的重要因素，其严重程度决定了相关并发症（如腹腔积液、食管胃静脉曲张破裂出血、肝性脑病、肝肾综合征等）的发生和发展[1-3]。据报道，全球患有肝硬化的人数超过3亿[4]，因肝硬化导致的死亡人数达120万[5]，且近年来死亡人数呈上升趋势[6-7]。门静脉压力的持续升高是门静脉血流由肝脏回流到下腔静脉时受阻而引起的[8]。PH是肝硬化患者从代偿期向失代偿期过渡的特征性标志[9]，临床显著性PH患者常出现腹水、食管胃静脉曲张破裂出血、细菌性腹膜炎、肝肾综合征、肝性脑病

等[10-11]。

PH的诊断金标准为肝静脉压力梯度（hepatic venous pressure gradient，HVPG），其测量方式是有创的，且对操作者的水平要求较高[3，12]。因此，临床上PH患者常因出现严重的并发症如急性静脉曲张破裂出血、顽固性腹水等以后，才得以确诊[13]。而在无显著并发症的早期门静脉高压阶段，HVPG检测接受度更低，并且对于服用门脉降压药物，行内镜、介入或外科手术治疗后需动态监测门脉压力情况的患者难以重复实施。因此，针对PH早期诊断、无创监测等方面一直是国内外学者的研究热点之一。更重要的是，PH的诊治模式不再是单一学科经验式诊疗，而是逐渐转变为多学科综合协作诊疗模式。PH全病程治疗方式将药物、内镜治疗、外科手术、介入治疗及肝移植等治疗方式序贯结合，以实现优势互补[11]。PH患者病程长、疾病涉及多个学科，会产生大量的临床数据和各类临床标本。因此，建立、维护和管理PH标本库，标准、规范地保存PH样本，对于PH发生的早期诊断和无创监测具有重要意义[14]。

生物标本库是一类集中保护人类材料的生物库，包括标本材料（组织、血液、尿液、唾液、脑脊液和大便等）、标本采集人信息（年龄、姓名、性别、疾病和采集日期等）以及后续采集人各种临床资料（病因、诊断、合并症、治疗方式、影像学资料、检验学资料及随访信息等），用于疾病诊断、新药研发和基础研究等重要领域[15-16]。目前国内已建立了多个不同种类的肿瘤标本库[17-19]，但PH的标本库建立还未见报道，此标本库的建立有助于为PH基础与临床提供实验保障，为PH早期诊断和无创监测方面的研究奠定基础。邢台市人民医院依托门脉高压研究中心和中心实验室的临床资源和技术优势，探索并成功建立PH生物样本库，并通过了相关质量控制，现总结报道如下。

1 材料和方法

1.1 生物标本入库管理

1.1.1 标本来源：PH标本源自2018 年10 月至2020年6 月就诊于本医院的患者，纳入标准：（1）年龄：18～75岁；（2）诊断为PH（临床或病理诊断）；（3）签署知情同意书。排除标准（符合以下任何标准之一）：（1）人体免疫缺损病毒及梅毒阳性者；（2）研究者认为不适于参与的任何医学或非医学状况。

1.1.2 仪器设备：超低温冰箱（海尔冰箱DW-86L490J），超低温冰箱（中科美菱DW-HL100），生物安全柜（Thermo1389 SERIES A2），液氮罐（东亚YDS-35-125），离心机（Thermo Multifuge X3），电动移液器，手动移液器。

1.1.3 标本收集

（1）血浆、血清标本的处理及保存：血液标本由专职科研护士采集，采用无添加剂的无菌采血管和添加EDTA抗凝剂的无菌采血管各抽血3 mL，样本采集后尽快以1 500 g/min离心10 min[20]，取血浆和血清各约1.5 mL，分别分装为3管，每管0.5 mL左右。每个冻存管管壁上分三行，写“样本编号、患者姓名、采样日期”三个信息，管盖上写“编号-标本类型。置冻存盒中放-80 ℃冰箱保存，避免反复冻融[21-22]。样本分装后原样本采集管即刻按医院医疗废弃物处理流程处理。

（2）尿液标本的处理及保存：发放一次性手套、尿杯和无菌采集管给患者，并告知患者尿液采集要点：排前段尿液，收集中段尿液约半管左右，拧紧盖子避免污染。收到尿液样本后立即分装为3 管并做标记，每管约1 mL。后续处理同前述“血浆、血清标本的处理及保存”。

（3）唾液标本的处理及保存：发放无菌采集管给患者，并告知患者唾液采集要点：随机时间点，漱5口水，每口漱超过10 s，蓄唾液10 s后，吐入无菌采集管，收集3 mL左右，拧紧痰杯盖子避免污染。工作人员收到唾液标本后立即分装为3管，每管1 mL。后续处理同前述“血浆、血清标本的处理及保存”。

（4）组织标本的处理及保存：符合纳入标准的患者，如果进行手术或穿刺活检，在不影响病理诊断取材的前提下收集组织标本。标本离体后30 min内，取肝脏或脾脏等组织（尽量冲尽血液），将标本切成小块（0.5 cm×0.5 cm，厚度＜0.5 cm）[14]。（1）新鲜保存的标本：将切好的标本放入冻存管，标记好后，迅速放入液氮快速冷冻，15 min后转入-80 ℃冰箱保存，避免反复冻融；（2）福尔马林保存的标本：将切好的标本放入装有福尔马林的管中，做好标记，常温保存。

1.2 生物标本库的管理

1.2.1 生物标本库临床数据采集及维护

（1）临床数据完整准确：与医院病理管理系统定制化对接，采集PH患者的临床信息，包括年龄、性别、体质数、门脉高压病因、体格检查结果、实验室指标、门脉系统解剖学资料（门脉直径、肝内分支情况、有无血栓、脾静脉及肠系膜上下静脉汇合情况等）、门脉血流动力学指标（门静脉流速、脾静脉、肠系膜上静脉流速、胃冠状静脉血流方向等）、肝脾弹性结果、胃镜结果、病理结果、治疗方案、治疗结果等，及时留存患者影像学图像（DICOM格式）。

（2）临床数据及时更新：入库患者如再次就诊，应及时更新患者最新临床数据资料，并由专人定期随访患者，补充患者预后及并发症信息。

1.2.2 生物标本的质控：根据PH标本留存的研究目的，对新入库的标本进行核酸、蛋白质、激素或微生物的质检，出具检测报告。放入标本库未使用的标本每一年进行一次质检，与最初的质检报告进行对比，评估标本的质量[21-22]。

1.2.3 生物标本的信息化管理：PH标本库管理采用海尔公司的标本库冷链智能系统。

（1）空间管理有序、准确、自动化：实现样本信息查询、定位、数据批量导入和导出等，提高了空间利用率，确保取样的准确性。

（2）智能化监管：温湿度自动监测并与手机链接随时随地查看。

（3）保障数据安全和个人隐私：完善的权限管理功能和操作记录功能，专人专管。

1.2.4 标本的销毁：标本库存放的标本存放时间超过一年，经过质检评估不能使用的标本，需严格按照医疗废物的流程进行处置，并做好交接和登记[19]。

1.3 统计学分析

采用Excel 2007 软件对数据进行收集整理，采用SPSS 21.0 进行统计分析。对血清样本保存前后DNA提取扩增结果进行正态性检验及方差齐性检验，血清样本保存前后DNA提取扩增结果为非正态分布计量资料，比较采用配对秩和检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 标本收集情况

截至2020年6月共收集标本1 121份，其中组织标本13份，外周血标本434份，尿液标本337份，唾液标本337份。外周血标本中收集血清223份，血浆211份。所收集对象年龄为18～75岁，中位年龄50.6岁，其中男性301例（65.5%）。

2.2 质量控制

随机选择标本库内为乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）所致门脉高压（HBV-PH）的患者，采集其入库时HBV-DNA扩增结果。从现有的血清样本库中，抽取保存期一年的HBV-PH患者入库时HBVDNA扩增结果为阳性的38份标本，检测其血清标本HBV-DNA有无降解。依据DNA提取和扩增试剂盒说明书提取和扩增血清标本的HBV-DNA，样本扩增均做了3 次重复，采用配对秩和检验对标本保存前后HBV-DNA扩增结果进行分析，标本保存前后无统计学差异（P＞0.05）（见表1），表明标本存放一年后仍可满足后续实验要求。

表1 冻存一年前后乙肝标本DNA提取扩增结果分析

3 讨论

PH是肝硬化患者的最重要并发症之一，全球每年因肝病死亡的人数约有200 万[7]。PH是肝脏血流动力学改变导致的疾病，是慢性肝病进展和死亡的重要危险因素之一。肝硬化门静脉高压患者在腹部外科手术中病死率更高，肝细胞癌合并PH患者的预后极差，因此控制门静脉高压可有效降低病死率[23]。有研究者通过收集血清标本，检测标志物发现在肝硬化食管静脉曲张但无出血史的患者中，TGF-β1与HVPG呈负相关[24]。因此，PH的早期发现和治疗成为研究的热点，科研机构对PH标本的需求也越来越多。

PH标本库是支撑门静脉高压科学研究发展的有力保障，是促进转化医学研究的关键，能够促进门静脉高压医学研究的发展并创造社会和经济效益，为人类的健康发展做出贡献。此标本库建立的优势如下：（1）能够促进PH病因学的研究；（2）是筛选新的标志物，找到新的治疗手段和方法等转化医学的基石；（3）能够推动门静脉高压研究产业化[25]。通过1年多的努力，目前此样本库已成功留存了门静脉高压血液标本434份，组织标本13份，尿液标本337份，唾液标本337 份。同时，定期每6 个月对血液（血清和血浆）标本、组织标本、尿液标本和唾液标本进行检测，发现标本保存质量良好，能够满足后续实验要求。此外，我们应用海尔公司标准版智能信息系统管理标本库，每例标本均有相对应的完整临床病历资料和随访资料。

PH无创诊断方面的研究一直是肝病领域的研究热点及难点，大多研究都是单中心的，而多中心、大样本的研究则需建立一个标准、规范的标本库。门静脉高压标本库的质量控制是标本库管理的关键，为科研提供合格标本的保障。本中心标本库通过1 年多的运行经验总结，标本库管理应注意以下几点：（1）标本的收集：标本的留存必须由经过培训的专人负责，严格遵循标本入库规范，尿液、唾液、血液和组织标本离体后应迅速处理，组织放置于液氮保存，时间不超过20 min，尽可能避免标本内核酸、蛋白质的降解及微生物状态的改变[26]。（2）标本库的日常维护：制定严格的标本库管理及操作规范，定期检测标本库的冷链系统及装置，保证器械设备温控及监控报警完好，避免标本反复冻融。（3）标本质控：定期随机抽取各类标本，检测标本中DNA和RNA的完整性，验证标本是否可用，保证标本能够满足科研要求，对于不能使用的标本，需严格按照医疗废物的流程进行处置。总之，PH严重威胁人类的健康和生命，加强对PH基础及临床方面的研究十分必要，因此建立多中心甚至全国范围内统一操作和质控标准的门静脉高压标本库意义重大，能够收集大量的临床标本和资料，用于核酸、蛋白质、微生物等生物标志物等的研究，实现PH早期诊断和无创诊断。

综上所述，我院初步建立了PH生物样本库，并进行了标准化的质量控制。后续，我院将继续开展更多种类PH标本的收集和质控，便于深入研究PH发生发展机制，为开发新的PH诊断方法和治疗方式提供保障。