利用玉米秸秆廉价生产鼠李糖脂的研究

张媛 常思源

摘 要：鼠李糖脂是一种重要的生物表面活性剂，在石油开采、农业、医药、化妆品及生物降解等不同领域有着广泛的应用。鼠李糖脂低产量、高成本的劣势极大地限制了其更为广泛的应用。研究铜绿假单胞菌PC-1以廉价的玉米秸秆稀酸解液生产鼠李糖脂的工艺，进一步对鼠李糖脂的发酵培养氮源和发酵条件进行优化，当玉米秸秆稀酸解液和含糖浓度NaNO3分别设定为20.0 g/L和15.0 g/L时，鼠李糖脂产量可达19.3 g/L。

关键词：鼠李糖脂;铜绿假单胞菌PC-1;玉米秸秆稀酸解液

在中国，每年玉米秸秆的产量约有3.5亿t，但长期以来仅有小部分的玉米秸秆用作饲养牲畜的粗饲料，大部分玉米秸秆被用作燃料或者直接焚烧，这不仅是资源的巨大浪费，也会对环境造成巨大污染[1]。鼠李糖脂（Rhamnolipid）是由假单胞菌或伯克氏菌类产生的一种生物代谢性质的表面活性剂[2]。亲水基团主要由1～2个鼠李糖环构成，憎水基团则由1～2个不同碳链长度的脂肪酸构成。鼠李糖脂具有乳化、增溶、分散、凝聚和降低界面张力等特性，已应用于石油开采、生物降解、食品保鲜剂等领域[3-5]。鼠李糖脂通常以微生物发酵制得，然而鼠李糖脂生产成本过高以及产率低，限制了其规模化生产及应用[6]。

玉米秸秆作为一种廉价易得的碳源，以其为原料生物合成鼠李糖脂，不仅可以有效降低生产鼠李糖脂的成本，而且降低了玉米秸秆的治理成本，实现了玉米秸秆的资源化利用。本研究以本实验室保存的菌株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1为出发菌株，以玉米秸秆稀酸解液为碳源生产鼠李糖脂，并优化了氮源种类，旨在建立鼠李糖脂的廉价生产工艺。

1    材料与方法

1.1  培养基与菌株

铜绿假单胞菌PC-1由本实验室分离筛选获得。

平板培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L、琼脂20 g/L。

初始发酵产酶培养基：Ca（OH）2中和预处理的玉米秸秆酸解液，NaNO3 0.5 g/L，KH2PO4 0.10 g/L，Na2HPO4·12H2O  0.10 g/L，MgSO4 0.01 g/L，FeSO4·7H2O 0.02 g/L，CaCl2·2H2O  0.01 g/L。

1.2  玉米秸秆酸解液的酸解获取

先将玉米秸秆放置在烘箱中进行烘干处理，取出后研磨处理成直径约为100目的颗粒。称取600 g玉米秸秆颗粒，将玉米秸秆颗粒与2%的稀硫酸混合（固液比为1∶10）后，121 ℃酸解1 h，待冷却后使用纱布过滤，去除玉米秸秆残渣后的清液即为玉米秸秆酸解液。

酸解过程中会产生甲酸、乙酸以及糠醛等抑菌成分，且酸解液的pH比较低，使用Ca（OH）2将玉米芯酸解液的pH直接调节到10，再回调至6.5。去除沉淀CaSO4后的酸解液直接用于后续的发酵。

1.3  铜绿假单胞菌PC-1发酵生产鼠李糖脂的氮源优化

采用發酵初始培养基，以NaNO3、NH4Cl、NH4NO3和（NH4）2SO4为无机氮源（初始添加量为5 g/L），以酵母粉、牛肉膏及蛋白胨为有机氮源（初始添加量为10 g/L），分析氮源种类对发酵的影响。

1.4  鼠李糖脂含量检测

采用苔黑酚法测定鼠李糖脂含量[7]。鼠李糖脂基在浓硫酸作用下脱水形成糠醛类化合物，与地衣酚结合显蓝绿色，可用分光光度计测定421 nm处的吸收值。

2    结果与讨论

2.1  玉米秸秆稀酸解液各组分测定

将玉米秸秆稀酸解液中和处理后的样品参照美国国家可再生能源实验的方法，采用高效液相色谱仪测定各组分，结果如表1所示。玉米秸秆稀酸解液以Ca（OH）2中和工艺处理后，总糖质量浓度约为27.8 g/L，其中，木糖质量浓度约为18.1 g/L，占总糖组分的65%左右，培养基中还含有阿拉伯糖6.5 g/L、葡萄糖1.6 g/L，乙酸约4.7 g/L，甲酸、糠醛等抑制物组分未检出。

2.2  玉米秸秆稀酸解液发酵生产鼠李糖脂

将Ca（OH）2中和的玉米秸秆酸解液的总还原糖质量浓度调整到20 g/L作为碳源，发酵培养5 d，结果如图1所示。当以酸解液为碳源时，鼠李糖脂产量为5.7 g/L;由于酸解液中主要含有木糖和阿拉伯糖，考察以木糖和阿拉伯糖为碳源对鼠李糖脂产量的影响。在同样条件下，木糖产量（6.4 g/L）显然优于阿拉伯糖（5.1 g/L）。不同碳源对菌株PC-1的生长量也有影响，以木糖为碳源的生长量最高。这些结果说明，铜绿假单胞菌PC-1具有良好的木糖代谢能力，能以廉价的玉米秸秆酸解液生长并生产鼠李糖脂。故玉米秸秆酸解液可作为菌株PC-1生产鼠李糖脂的碳源。

2.3  铜绿假单胞菌PC-1生产鼠李糖脂发酵条件优化

2.3.1  氮源对菌株PC-1生产鼠李糖脂的影响

氮源也是微生物合成代谢产物重要营养物质。本研究考察NaNO3、NH4Cl、NH4NO3、（NH4）2SO4、酵母粉、牛肉膏及蛋白胨等7种氮源对菌株PC-1产鼠李糖脂的影响，结果如图2所示，NaNO3最有利于鼠李糖脂的合成，蛋白胨对菌体生长最为有利。以NaNO3为氮源时，鼠李糖脂产量最高达12.4 g/L，而以NH4Cl、NH4NO3和（NH4）2SO4作为氮源时，菌株PC-1产的鼠李糖脂产量较低，可能该菌株不善于利用氨类氮源。此外，有机氮源更有利于菌体PC-1的生长，而无机氮源则更有利于产物积累。故选用NaNO3为菌株PC-1生产鼠李糖脂的氮源。

2.3.2  碳氮比对菌株PC-1生产鼠李糖脂的影响

碳氮比（C/N）对微生物的生长和代谢有着重要影响，在上述最佳碳源氮源下，进一步调整碳源氮源的投加比，以10 g/L NaNO3为氮源，调节酸解液含糖质量浓度分别为10、20、30、40、50 g/L，发现酸解液含糖质量浓度为30 g/L时，菌株PC-1的鼠李糖脂产量最高达17.7 g/L，故确定酸解液含糖质量浓度最佳为30 g/L。控制酸解液含糖质量浓度为     30 g/L，调节NaNO3的质量浓度分别为10、15、20、25、30 g/L，测得NaNO3为15 g/L时，菌株PC-1的鼠李糖脂产量达到最大值18.5 g/L。因此，在后续研究中，培养基酸解液含糖质量浓度及NaNO3分别设定为20.0 g/L和15.0 g/L。

3    结语

以实验室自行筛选保存的铜绿假单胞菌PC-1为出发菌株，利用廉价的玉米秸秆稀酸解液为碳源生产生物表面活性剂鼠李糖脂，进一步对鼠李糖脂的发酵培养氮源进行优化。当玉米秸秆稀酸解液含糖质量浓度和NaNO3质量浓度分别设定为20.0 g/L和15.0 g/L时，鼠李糖脂产量可达19.3 g/L。

[参考文献]

[1]张红漫，雷鸣柳，郑荣平，等.HPLC法测定蒸汽爆破玉米秸秆水解液中的糖含量[J].食品科技，2011，36（6）：292-296.

[2]陈利娟，吴斌，何冰芳.ARTP诱变选育鼠李糖脂高产菌及鼠李糖脂促进枯草芽孢杆菌产纤维素酶的研究[J].生物技术通报，2015，31（11）：195-201.

[3]张婧波，吴剑荣，蒋芸，等.以抽油烟机废油为原料发酵产鼠李糖脂的研究[J].生物技术通报，2018，34（5）：195-200.

[4]杨佐毅，崔佳豪，李平凡，等.一株铜绿假单胞菌的筛选鉴定及其产鼠李糖脂条件的优化[J].环境污染与防治，2018，40（2）：128-132.

[5]张熠，刘洋，陈鹏，等.铜绿假单胞菌发酵生产鼠李糖脂的研究[J].食品与发酵科技，2019，55（1）：1-4.

[6]蔡京荣，吕佳佳.生物表面活性剂鼠李糖脂研究概况[J].中国洗涤用品工业，2019（4）：60-67.

[7]KOCH A K，KAPPELI O，FIECHTER A，et al.Hydro carbon assimilation and biosurfactant production in Pseudomonas aeruginosa mutants[J].Journal of Bacteriology，1991，173（13）：4214-4219.

Study on  cost-effective production of rhamnolipid from biomass waste by fermentation

Zhang Yuan， Chang Siyuan

（1.Nanjing Zoonbio Biotechnology Co. Ltd.， R&D Department， Nanjing 210034， China; 2.College of Biology and

Environment， Nanjing Polytechnic Institute， Nanjing 210048， China）

Abstract：Rhamnolipid is an important biosurfactant， which is widely used in petroleum exploitation， agriculture， medicine， cosmetics and biodegradation. The low yield and high cost of rhamnolipid limit its wider application. In this study， the technology of rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa PC-1 was studied. Furthermore， the nitrogen source and fermentation conditions of rhamnolipid were optimized. When the mass concentrantions of corn straw dilute acid hydrolysate and NaNO3 were set at 20.0 g/L and 15.0 g/L respectively， the rhamnolipid yield was 19.3 g/L.

Key words：rhamnolipid; Pseudomonas aeruginosa PC-1; corn straw dilute acid hydrolysate

基金項目：南京科技职业学院校级科研课题（NHKY-2019-18）

作者简介：张媛（1986— ），女，工程师，硕士;研究方向：生物医药。

通信作者：常思源（1986— ），男，讲师，博士;研究方向：生物产品分离提取。