黄芪类中药中芒柄花素和毛蕊异黄酮的HPLC测定

陈洁

摘 要：黄芪作为一种经典的中药，在临床中能够起到补中益气、利水消肿、敛汗固脱的功效。现代研究认为其还有调节血压、增强免疫力以及保护心肝的作用，在临床中具有非常重要的药用价值。很多中成药中都含有黄芪，基于此，运用高效液相色谱（HPLC）测定法对中药黄芪中所含的异黄酮类成分进行测定。逐一对成品中的芒柄花素（F）、毛蕊异黄酮（C）以及黄芪异黄烷苷（A）进行定性检测，并对F和C的含量进行了有效的测定，以期为临床用药提供安全保障。

关键词：黄芪类;HPLC测定法;芒柄花素（F）;毛蕊异黄酮（C）

现阶段，随着我国对药品安全的重视程度不断提高，为了保障用药安全，需要对药品中的各种药物成分及其含量进行有效测定，确保其按照相应的比例进行配比，保障临床用药的安全。目前，对于黄芪质量控制多选用黄芪甲苷作为标准进行测定，但检测仪器需要蒸发光散射检测器，导致成本较高。运用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定法对其中所含的异黄酮类成分及含量进行定性和定量的检验，能够有效提高黄芪质量标准，现将相关结果报告如下。

1    仪器、试剂以及样品的准备

整个测定过程所用的仪器为高效液相色谱仪、色谱柱，用到的试剂为无水乙醇、正庚烷溶剂，并保证所用试剂等级均为AR级。黄芪药材均由实验室人员采集、收集和鉴定，并按照品种进行分类，分为蒙古黄芪（主要产地为山西、河北、内蒙古）、荚膜黄芪（主要产地为四川、黑龙江）、多花黄芪（主要产地为甘肃、青海、西藏）以及金翼黄芪（主要产地为陕西、寧夏）。HPLC测定条件：层析柱YWG80-5 μm，流动相：正庚烷-无水乙醇-水-乙酸乙酯（80.00∶20.00∶0.05∶0.05），流速：1 mL/min，检测波长：280 nm（定性）或250 nm（定量）。

2    方法与结果

2.1  运用HPLC对黄芪中的异黄酮类成分进行定性测定

准备黄芪细粉2 g，向其中加入30 mL乙醇溶液，将溶液充分混合，通过水浴回流对溶液进行提取和过滤，并将得到的滤液放入蒸发皿中进行水浴加热蒸发，得到残留物。向残留物中加入质量分数为0.3%的氢氧化钠溶液10 mL进行充分溶解，而后过滤。用稀盐酸将滤液的pH调整为5～6。再将溶液分配到分液漏斗中，并用20 mL的乙酸乙酯溶液对其进行萃取，得到乙酸乙酯层，用无水硫酸钠对溶液进行脱水处理，继而过滤。利用1 mL的乙酸乙酯溶液溶解得到滤液，进而得到测定试样溶液[1-2]。

先通过F、C以及A的对照品溶液进行样品的层析，将检测仪器的波长定为280 nm，其他HPLC测定条件不变。分别取上述过程中的溶液1～2 μL进行层析，发现试液中已经包含了这3种异黄酮成分，在所检测的10种试样中，均能检测出F、C、A成分的存在。

2.2  运用HPLC对黄芪中的异黄酮类成分F、C进行定量测定

2.2.1  检测色谱条件

根据F、C对紫外线（UV）光谱的最大吸收量，确定其波长为250 nm。流动相：用不同配比的正庚烷-无水乙醇-水-乙酸乙酯等系统进行测定实验，并根据被测定成分分析分离情况，确定最后配比为80.00∶20.00∶0.05∶0.05，保持水浴流速为1 mL/min，层析柱压为90 kg/cm2。在此测定条件下，F的保留时间为5.23 min，C的保留时间为7.54 min。

2.2.2  标准曲线

取适量含有无水乙醇溶液的F与C（其中含有F 0.036 9 mg/mL，含有C 0.163 5 mg/mL）。并用微量注射器分别对1、2、3、4、5 μL相关溶液进行层析，以峰高值作为纵坐标，以进样量作为横坐标，绘制相关测定值的标准曲线。得出F的质量在0.036 9～0.193 5 μg内呈线性相关，C的质量在0.163 5～0.832 1 μg内呈线性相关，并得出回归方程分别为：

F∶Y=142 7+808 6 X，r=0.993 5

C∶Y=﹣306+578 1 X，r=0.993 8

2.2.3  精密度

对上述溶液进行5 μL进样，连续试验5次，能够测得F的平均峰高为42 168，CV=1.67%;测得C的平均峰高为29 518，CV=0.86%。

2.2.4  具体的测定方法

精密称取黄芪细粉，取3 g放入索氏提取器中，加入     90 mL无水乙醇溶液进行过夜浸泡。通过水浴回流提取出无色的浸出液，整个水浴回流的过程将持续5 h，将得到的浸出液转入蒸发皿中，通过水浴加热得到残留物，并分别用  20 mL的乙醚和20 mL质量分数为0.5%的盐酸溶液进行交替溶解，进而将溶解液分别转入分液漏斗中进行分层并取乙醚层。得到的乙醚层再用10 mL的乙醚提取两次，合并后的乙醚溶液用质量分数为0.3%的氢氧化钠溶液10 mL进行3次提取，最后合并碱溶液，用稀盐酸将溶液的pH调整为5～6后，分别用10 mL的乙醚溶液进行4次提取，最后合并乙醚溶液，用无水硫酸钠进行脱水处理，并通过过滤除去其中所含的乙醚，得到的残留物再用2 mL的无水乙醇进行洗涤和溶解，并将得到的溶液转入容量为2 mL的容量瓶中，再加入无水乙醇至相关刻度摇匀，然后将其按照上述对HPLC测定条件的设置，进行3 μL试样层析测定，并用外标两点法对F、C进行定量测定。

2.2.5  回收率的测定

运用HPLC测定法测定2 g黄芪样品的F和C含量，并精密称取对照样品2 g，按照同种方法对其进行测定，计算出回收率，结果为：F的回收率为97.36%，CV=4.61%;C的回收率为98.13%，CV=4.94%，n=3。

2.2.6  樣品测定结果

样品测定结果如表1所示。

3    结语

运用HPLC测定法对黄芪类药物中的F、C、A进行定性测量，并对其中的F和C进行定量测量，测试过程灵敏度高、重现性好。同时，所用的流动相系统以及样品预处理方式简单、快捷，能够对黄芪中所含的异黄酮成分进行有效测定，为黄芪质量标准提供了借鉴。鉴于黄芪中所含的异黄酮成分具有很好的溶解性，整个测试过程用乙醚溶液进行提取，并考察了整个过程F和C的回收率。

通过实验发现，无论是哪个产地的黄芪，经过HPLC测定方法进行测定后，都能得出其含有F、C以及A的结论，并且再对F和C进行定量测量，能够计算出10种样品中F和C的含量，以便临床使用时，根据具体要求选择适合的黄芪类药物。

异黄酮类物质是黄芪类药物中的重要组成部分，在黄芪中占有很大的比例，且异黄酮类物质直接决定了黄芪类药物的药理性质，异黄酮类物质含量的增加、异黄酮类物质含量的下降，都将导致黄芪类药物质量改变。因此，实验室需要运用HPLC测定法对黄芪类中异黄酮物质进行定性和定量测量，以此来保障黄芪的质量。

[参考文献]

[1]撒伟文，王宝琴.黄芪类中药中芒柄花素和毛蕊异黄酮的HPLC测定[J].中成药，1991，13（9）：32-33.

[2]杨星辰，史秀峰，杨费莉.高效液相色谱法考察黄芪蜜炙前后4种异黄酮含量的变化[J].中南药学，2012（2）：15-18.

High performance liquid chromatography determination of Formononetins and Pistil isoflavones in Astragalus membranaceus

Chen Jie

（Nanjing Jinling Pharmaceutical Co. Ltd.， Jinling Pharmaceutical Factory， Nanjing 210038， China）

Abstract：As a classic Chinese medicine， Astragalus membranaceus can play the role of tonifying， promoting diuresis and detumescence， astringent and solid off. Modern studies suggest that it can also regulate blood pressure， enhance immunity and protect the heart and liver， which has very important medicinal value in clinic. Many Chinese patent medicines contain Astragalus. Based on this， the isoflavones in Astragalus were determined by high performance liquid chromatography. The quality of Formononetin（F）， Pistil isoflavones（C）and Astragaloside（A） in the finished product were detected one by one， and the contents of F and C were determined effectively， in order to provide safety guarantee for clinical medication.

Key words：Astragalus membranaceus; high performance liquid chromatography determination; Formononetin（F）; Pistil isoflavones（C）