高效液相色谱法测定四季青中长梗冬青苷

2021-05-07蒋婷婷郑金星林雪志

化学分析计量 2021年4期

蒋婷婷，郑金星，林雪志

（浙江福立分析仪器股份有限公司，浙江台州 317500）

四季青是一种中药材，为冬青属植物冬青的干燥叶，广泛分布于长江以南的各省，叶片呈椭圆形或披针形，具有清热解毒、凉血止血、收敛生肌等功效［1–4］，临床上用于急性支气管炎、肺炎、急性咽喉炎、胆道感染、尿路感染、痢疾、烧伤、下肢溃疡、皮炎等疾病治疗［5–6］。现代研究证实，四季青也可以改善心血系统功能，可用于冠心病、心绞痛以及病毒性角膜炎等疾病［7］。

从四季青中可分离出原儿茶酸、咖啡酸、丁香苷、龙胆酸、异香草酸、长梗冬青苷等［8］，长梗冬青苷是四季青的主要有效成分，又名具栖冬青苷，属于五环三萜类化合物。目前研究证明长梗冬青苷具有抗炎、抗心律失常、心肌缺血和脑缺血作用［9］。在2020 年《中国药典》中明确要求四季青中长梗冬青苷的含量不得少于1.35%［10］。毕福钧等［11–14］采用高效液相色谱–紫外检测器（HPLC–UV）法测定长梗冬青苷，使用210 nm 及更低的波长作为检测波长，流动相易干扰，紫外检测器噪音大，灵敏度低。魏秀丽等［15］采用超高效液相色谱–二极管阵列检测器（UPLC–PAD）法对长梗冬青苷进行测定，虽然能够快速的定量测定，但灵敏度低，且UPLC 设备昂贵，该方法不具有普适性。Waiou Zhao 等［16］采用液相二级质谱（LC／MS／MS）法测定，虽然灵敏度高，但设备昂贵，现阶段无法全面推广。高效液相色谱仪价格低廉，操作简单，同时蒸发光散射检测器（ELSD）不受流动相影响，可检测任何挥发性低于流动相的样品，检测灵敏度高。目前国内外未见采用高效液相色谱–蒸发光散射检测器（HPLC–ELSD）法测定四季青中长梗冬青苷含量的方法。

笔者通过信噪比确定了检测器的最佳检测条件，构建的HPLC–ELSD 方法使用成本低，简单易实施，具有较高的准确度和灵敏度，可用于中药材四季青中长梗冬青苷的含量检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC5090 型，浙江福立分析仪器股份有限公司。

蒸发光散射检测器：UM5800 型，上海通微分析技术有限公司。

电子天平：SQP 型，感量为0.1 mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

数控超声波清洗器：KQ5200 型，昆山市超声仪器有限公司。

破壁机：MJ–BL1543A 型，美的集团。

一次性注射器：5 mL，上海安谱实验科技股份有限公司。

过滤膜：0.22 μm，上海安谱实验科技股份有限公司。

甲醇、异丙醇：均为色谱纯，美国天地公司。氮气：纯度不小于99.2%，浙江海畅气体有限公司。长梗冬青苷标准物质：批号为8547，含量99.9%，上海诗丹德标准技术服务有限公司。

长梗冬青苷标准溶液：精确称量长梗冬青苷标准物质0.003 2 g 于10 mL 容量瓶中，加入甲醇–水（8∶2）溶液，配制成质量浓度为0.32 mg／mL 的长根冬青苷标准溶液。

水：饮用纯净水。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：Sapphiresil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，浙江福立分析仪器股份有限公司）；柱温：30 ℃；ELSD 漂移管温度：50 ℃；气体流量：2.5 L／min；流动相：A 相为甲醇–异丙醇（9∶1）溶液，B 相为水–异丙醇（9∶1）溶液，流量为1.0 mL／min，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度淋洗程序

1.3 样品处理

将四季青叶放入破壁机中粉碎3 min，精确称取粉末1.000 0 g于具塞锥形瓶中，加入50 mL 甲醇–水（8∶2）溶液，称重并记录重量，超声30 min，放冷后再次称重，用甲醇–水（8∶2）溶液补足质量，摇匀，用一次性注射器吸取溶液，再用0.22 μm 的过滤膜过滤，制备成样品溶液，备用。

2 结果与讨论

2.1 漂移管温度选择

在气体流量为2.5 L／min 的条件下，分别设置ELSD 漂移管进样温度分别为40、50、55、60、65 ℃，分别考察不同漂移管温度对信噪比的影响，测定结果列于表2。由表2 可以看出，随着漂移管温度的升高，色谱峰高与噪音均呈先降低后升高的趋势，而信噪比呈先升高后降低趋势，综合考虑，选择漂移管温度为50 ℃。

表2 不同漂移管温度的测定结果

2.2 气体流量选择

设定ELSD 漂移管温度为50 ℃，分别选择气体流量为2.0、2.5、3.0 L／min，分别考察不同气体流量对信噪比的影响，测定结果列于表3。由表3 可以看出，当气体流量为2.5 L／min 时色谱峰高于最大值，噪音最小且信噪比最优，因此选择气体流量为2.5 L／min。

表3 不同气体流量的测定结果

2.3 系统适应性试验

分别取10 μL 长梗冬青苷标准溶液和样品溶液，在1.2 条件下进行测试。测试结果表明，标准溶液中长梗冬青苷的柱效是39 518，样品溶液中长梗冬青苷的柱效是37 842，均满足2020 年中国药典要求柱效不低于2 000 的要求。长梗冬青苷标准溶液和样品溶液色谱图分别如图1、图2 所示。

图1 标准溶液色谱图

图2 样品溶液色谱图

2.4 线性关系、检出限、定量限

取0.32 mg／mL 长梗冬青苷标准溶液，分别进样5、10、20、50 μL，按1.2 仪器工作条件测定，以长梗冬青苷进样质量的对数（x）为横坐标，对应色谱峰面积的对数（y）为纵坐标，建立线性方程。结果表明长根冬青苷进样质量在0.16～16 μg 范围内线性关系良好，线性方程为y=1.65x+2.5，相关系数为0.999 9。

分别配制一定浓度的长梗冬青苷标准溶液，按1.2 仪器工作条件进样10 μL，使其分别满足信噪比为3∶1、10∶1 的要求，计算检出限和定量限。得到方法检出限为0.016 mg／mL，定量限为0.048 mg／mL，满足分析要求。

2.5 仪器精密度试验

取0.32 mg／mL 长梗冬青苷标准溶液进样10 μL，连续重复进样6 次，保留时间和色谱峰面积的测定结果列于表4、表5。由表4、表5 可知，保留时间相对标准偏差为0.140%，色谱峰面积相对标准偏差为0.864%，均不大于2%，表明仪器具有较好的精密度，符合药典规定。

表4 仪器精密度测定结果（保留时间计）

表5 仪器精密度测定结果（色谱峰面积计）

2.6 加标回收试验

分别精密称取6 份同一批已测定长梗冬青苷含量（800 μg／mL）的样品1.00 g，置于具塞锥形瓶中，分别加入16、48、320 μg／mL 长梗冬青苷标准溶液，按1.2 仪器工作条件测定，结果列于表6。由表6可知，长梗冬青苷的加标回收率为96.25%～98.89%，测定结果的相对标准偏差为0.30%～3.56%，表明本法具有较高的准确度与精密度。