超声微泡爆破辅助骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠慢性肾病

夏春娟，王家平，杨杨，李天祎，邵丽诗，马逸群，张娅

昆明医科大学第二附属医院，昆明650101

慢性肾病（CKD）是一种慢性疾病，临床表现为蛋白尿、肾小球滤过率正常或降低，以及进行性肾小球、肾小管和间质损害［1］。CKD的特征在于肾功能的进行性丧失，导致终末期肾脏疾病和胶原蛋白的积累，引起的炎症，导致肾脏纤维化［2］。目前针对CKD患者采用药物、透析或肾脏移植等方式治疗，尽管可以改善整体肾脏功能，但不能促进周围组织再生和功能恢复［3］。近年来，骨髓间充质干细胞（BMSC）移植已广泛应用于各类型肾病的治疗，BM⁃SC能分化成肾脏细胞和血管组织，实现受损肾脏细胞再生，从而改善肾脏功能［4］。尽管大量研究证实干细胞对各类肾脏疾病治疗具有有效性，但其归巢率和存活率低仍限制着其对靶器官充分发挥作用，因此促进干细胞向靶器官归巢是治疗的关键。超声造影剂是一种含直径0.5～10µm气泡的液体，含有的微气泡由于破坏后产生空化效应、生物学效应等，因此可提高药物靶向和基因治疗［5］。本研究基于经肾动脉移植BMSC基础上加入超声微泡，观察两者联合治疗大鼠CKD的疗效，旨在探索安全有效的方法来提高BMSC归巢率，从而更有效的发挥对CKD肾脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物18周龄健康雄性SD大鼠44只，清洁级（由昆明医科大学实验动物中心提供），体质量150～180 g；选取34只用于构建CKD动物模型，10只为正常对照。另选4周龄健康雄性SD大鼠2只，体质量100 g，为BMSC供体。

1.2 BMSC制备 选4周龄SD大鼠2只，脱颈处死，75%乙醇全身浸泡10 min，生理盐水冲洗干净，严格按无菌操作分别取双侧胫骨、股骨，骨髓腔充分暴露，5 mL注射器抽取磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗骨髓腔3～4次，骨髓腔冲洗液收集后混匀、过滤、离心，用10%胎牛血清（美国Gibco公司）、含1%青链霉素双抗（美国Gibco公司）L-DMEM培养基重悬细胞，随后接种至T25细胞培养皿中，置于细胞培养箱中孵育，2 d后首次换液，之后依次间隔3 d换液，待细胞生长融合90%～100%时用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索莱宝科技公司）消化细胞，P3代细胞培养行成脂、成骨诱导分化，流式细胞仪（德国Beckman coulter公司）检测细胞表面抗原CD45、CD90。倒置相差显微镜下见BMSC间有一定黏附性，呈长梭形、多边形、“涡状”贴壁生长。成脂诱导培养2周末油红O染色，可见染成红色的脂肪细胞；成骨诱导培养4周末茜素红染色，可见细胞质内钙结节被染成橘红色（证明骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能）。P3代BMSC表面抗原CD45表达率为11.5%、CD90表达率为99.96%（鉴定骨髓间充质干细胞）。

1.3 超声微泡制备 将超声微泡造影剂（声诺维造影剂，意大利Braco公司）按照说明书配置成混悬液，即在装有造影剂的小瓶里注入0.9%生理盐水5 mL，然后用力振摇瓶子，直至冻干粉末完全分散，微泡浓度为2×108个/mL，平均直径为2.5µm（配置标准超声微泡剂量）。

1.4 CKD模型制备及超声微泡爆破辅助骨髓间充质干细胞移植治疗方法 选取18周龄SD大鼠34只，自由饮水、饮食适应性喂养1周。固定后经尾静注阿霉素3 mg/kg（美国Sigma公司），14 d时再次注射相同剂量阿霉素。之后每周经尾静脉采血，平均为7周，以血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）和24 h尿蛋白水平升高，且病理切片行HE染色示CKD改变为造模成功标准［6］。造模实验过程中死亡1只，造模后饲养期间死亡3只，最终30只制模成功并纳入后续实验。30只CKD大鼠随机分为BMSC+微泡组、BMSC组、CKD组各10只，造模7周末各组开始同时治疗。各组大鼠均以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，无菌手术台固定，暴露腹部，脱毛，碘伏消毒，铺无菌手术单，切开皮肤，逐层分离至显示肾动脉。BMSC+微泡组：经肾动脉注射0.5 mL的BMSC（2×106/mL），紧接着注入0.5 mL的声诺维造影剂（2×108个/mL），注射完毕后立即启动西门子S3000超声诊断仪（美国西门子医疗系统公司），采用9L4高频线阵探头配备造影模式：传输频率为7.5 MHz，机械指数0.04，每隔10 s对两侧肾脏分别爆破1次，共3次。BMSC组：经肾动脉注射0.5 mL的BMSC（2×106/mL）悬液。对照组及CKD组：经肾动脉输注等量0.9%氯化钠溶液。术毕，逐层缝合大鼠腹部切口，切口处及肌内分别注射抗生素抗感染，置入饲养笼保温、饲养。

1.5 尿蛋白及血清BUN、Cr检测和肾脏病理评估 ①尿蛋白及血清BUN、Cr检测方法：造模第8周，将各组大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿液，存储在-70℃冰箱。经腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g），待完全处于麻醉状态下，经尾静脉采血，使用自动生化分析仪（日立7170型，日本）检测尿蛋白及血清BUN、Cr。治疗1周后，将各组大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿液，经尾静脉采血，使用自动生化分析仪检测尿蛋白及血清BUN、Cr。治疗2周后，将各组大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿液。第2天依次经腹腔注射10%水合氯醛，待完全处于麻醉状态下，使用一次性静脉采血针穿刺心脏采血后，一部分将血液样品收集到血清收集凝胶管中放置室温1 h进行凝结，然后将样品以3 500 r/min离心15 min分离血清，使用自动生化分析仪检测尿蛋白及血清BUN、Cr。②肾脏病理评估方法：紧接着灌注后立即取出各组肾脏组织，固定在10%甲醛中，选取部分肾皮质（1 mm×1 mm×1 mm）组织放入多聚甲醇溶液中。经过固定、脱水、包埋、制作石蜡切片，HE、Masson染色后，在光学显微镜下（日本Nikon公司）由3名不同病理科医生观察并描述，纤维化评分依病变由轻至重的程度，阴性记0分，少量记1分，中等量记2分，多量记3分，大量记4分。

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。计量资料以±s表示，治疗前后比较采用配对T检验，采用方差分析行多组间比较，两两比较采用L-LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组治疗前后血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平比较 治疗前后血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平比较见表1。

表1 各组治疗前后血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平比较（±s）

表1 各组治疗前后血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平比较（±s）

注：与同组治疗前比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05；与CKD组比较，cP＜0.05；与BMSC组比较，dP＜0.05。

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2.2 各组肾脏组织病理变化比较 对照组HE染色显示肾小球及肾小管正常、基底膜未见增生、未见炎性细胞；Masson三色染色未见染色胶原纤维，评分为0分。CKD组HE染色显示肾小球囊扩张、肾小球内见大量空泡、部分肾小管萎缩、基底膜不同程度增生、间质部炎性细胞大量分布；Masson三色染色显示肾小管间质周围大量蓝色着染胶原纤维，评分为4分。BMSC组HE染色显示少量肾小球囊扩张、肾小球内见少量空泡、少量肾小管萎缩、部分肾小管管型、基底膜增生程度减少、间质炎性细胞分布减少；Masson三色染色显示肾小管间质周围少量蓝色着染胶原纤维，评分为2分。BMSC+微泡组HE染色显示极少量肾小球囊扩张、肾小球内见极少量空泡、极少量肾小管萎缩及肾小管管型、基底膜增生程度减少、间质炎性细胞分布明显减少；Masson三色染色显示肾小管间质周围极少量蓝色着染胶原维，评分为1分。详见图1。

3 讨论

阿霉素是一种蒽环类抗生素，广泛应用于多种肿瘤治疗，其主要不良反应是引起心脏和肾脏毒性。阿霉素诱导的肾损伤性肾病是公认的啮齿动物模型，目前大量应用于肾脏疾病进展机制、治疗方法等研究［7］。阿霉素引起的肾毒性其机制复杂，病理上主要表现为肾小球破坏和肾小管间质损害导致肾小管间质纤维化和肾小球硬化［8］，主要表现为严重的蛋白尿，血尿和水肿。以往治疗阿霉素肾病主要采取药物、透析或者肾移植［9］，但其治疗费用昂贵且无法逆转肾脏修复，因此治疗受到限制。

图1 各组大鼠肾脏组织HE染色和Masson三色染色病理图片（×400）

BMSC是一类在特定条件下具有自我更新和多能分化潜能的细胞群。国内外实验研究表明，BMSC通过促进分泌细胞生长的因子、细胞旁分泌、细胞外囊泡分泌等机制为BMSC细胞移植营造良好的微环境，从而抑制炎症反应、引发组织再生、促进血管生成［10］。随着研究的不断深入，证实BMSC在各类型肾脏疾病治疗中取得较好的效果［11］。BMSC移植治疗CKD受影响因素颇多，包括体内受环境、免疫、代谢等［12］。体外细胞增殖、定向归巢能力、移植过程中细胞数量及次数不同等，均会造成BMSC衰老、凋亡甚至死亡，影响治疗效果。目前提高BMSC的移植成功率是研究热点，包括不同移植途径、移植次数、基因修饰，细胞表面工程和体外诱导等方式［13］，其中移植方式的选择很大程度影响移植成功率。超声微泡在受到机械波的作用下产生爆破后发射微射流，细胞膜上钙、钠离子等通道开放，周围毛细血管通透性增加，使得BMSC更有效地进入靶器官和组织。同时通过改变细胞周围微环境促进内分泌因子分泌，有利于干细胞向靶器官的归巢［14］。由于超声微泡爆破作用于靶器官时间短暂因此对BMSC的增殖和存活没有影响［15］。因此，本研究采取以往前期研究团队的移植方式即经肾动脉移植［16］基础上加入超声微泡爆破以观察其疗效。

本研究通过BMSC组、BMSC+微泡组与CKD组比较，BMSC组24 h尿蛋白；BMSC+微泡组24 h尿蛋白、血清Cr、血清BUN移植第2周末降低明显，HE提示两组均肾小球囊部分扩张、肾小球内空泡减少、部分肾小管扩张、基底膜增生不同程度减少、间质炎性细胞浸润有所减少。Masson三色染色显示肾小管间质周围胶原纤维减少，证明BMSC可使部分受损肾组织修复。研究［17］表明，BMSC通过减轻炎症反应、增强对受损组织的修复能力等来减轻或逆转CKD肾脏受损程度相符。本研究还显示，BMSC+微泡组与BMSC组比较24 h尿蛋白、血清Cr、血清BUN降低；且较CKD组降低明显，HE染色及Masson三色染色显示CKD病理改变较BMSC组改善明显。证明超声微泡联合BMSC移植，能更有效的减轻纤维化及恢复部分结构，促进大鼠CKD肾脏其功能恢复。这与部分研究认为超声介导的微泡促使BMSC相应组织或器官修复，从而改善相应功能相符［18］。研究［19］发现，超声介导的微泡对急性心肌梗死大鼠受损心肌可起到修复作用。研究［20］证明，超声微泡介导的BMSC可以通过抑制炎症、减少肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-1β表达进而治疗大鼠前列腺炎。超声微泡爆破联合BMSC移植促进修复大鼠CKD肾脏的机制可能为：①超声微泡爆破后会引起肾微血管短暂炎性信号反应吸引更多BMSC向肾脏归巢；②超声微泡爆破后瞬时产生流体微喷、冲击波和空化效应，作用于细胞膜上产生剪切应力，从而破坏血管内皮细胞内膜、内皮细胞短暂收缩、间隙增宽并增加血管通透性，促使BMSC在肾微血管里聚集、循环增多［21］；③超声微泡爆破后可能引起肾脏微环境改变，某些生长因子或细胞因子表达增加，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6，这些因素均吸引BMSC向肾脏区域归巢，促进肾脏局部血管生成及减少纤维化；④超声微泡爆破后导致靶向区域肾细胞内、外热力学改变、能量聚集、代谢增强，有利于BMSC分化、增殖。

总之，超声微泡爆破联合BMSC移植治疗大鼠CKD效果较好，其可减轻大鼠CKD肾脏损伤程度，改善肾脏功能。