酶联免疫斑点法与ELISA法诊断结核病临床价值的研究

河南省唐河县人民医院（473400）张陆

结核病为临床常见的一种慢性疾病，主要因结核菌感染导致，且该疾病具有传染性，病变部位包括肺部、脑膜、腹膜、皮肤等，其中肺部为多发部位，主要临床表现为咳嗽、盗汗、乏力、低热、消瘦等，若未及时采取措施治疗，将严重影响患者生命健康[1][2]。而尽早诊断，尽早治疗对控制结核病病情具有重要作用，近年来，随着结核病的诊断技术与辅助试验不断发展，γ干扰素释放试验逐渐被用于结核病临床诊断中，且具有较高的灵敏度与特异性[3]。目前，酶联免疫斑点法（Enzyme linked immunospot assay,ELISPOT）与酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）均为γ干扰素释放试验中常用的两种检测方式，但临床对于两种检测方式诊断结核病的临床价值尚存在一定争议。基于此，本研究旨在分析ELISPOT与ELISA应用于结核病诊断中的临床价值，旨在为临床诊断疾病提供依据。具体信息如下。

附表1 两种检测方法对结核病的诊断效果

附表2 两种检测方法对结核病的诊断效能分析

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年3月～2020年3月我院收治疑似结核病患者共80例作为研究对象，经我院医学伦理委员会批准（2018年审（106）号）。其中男性49例，女性31例；年龄37～63岁，平均年龄（45.12±3.26）岁；体重指数（BMI）17～23kg/m2，平均BMI（20.85±1.02）kg/m2。

1.2 入选标准 （1）纳入标准：①具有良好的沟通能力者；②均行ELISPOT与ELISA法进行检测者；③临床资料完整者；④配合度理想者；⑤自愿签署知情同意书者。（2）排除标准：①处于哺乳期、孕期的妇女；②凝血功能障碍者；③过敏体质者；④合并艾滋病者；⑤伴有糖尿病、高血压等疾病者；⑥合并肝、肾等器官功能衰竭者。

1.3 方法 提前向所有入选者说明采血要求：空腹10h以上、采血前30min禁止剧烈运动、保持情绪稳定。（1）ELISPOT：使用上海复星代理的进口T-SPOT试剂盒，检测方法：采集4ml静脉血，置于肝素抗凝管中，采用密度梯度离心法分离血液样本单个核细胞（PBMC），将测试液浓度调整为2.5×109/mL，分别取100μL加入阴性培养基（AIM-V），测试抗原A培养基（ESAT-6），测试抗原B培养基（CFP-10）及阳性培养基（植物血凝素A），将其放入37℃下孵育，时间为16～20h，再使用无菌1×PBS进行洗涤4次，加入酶标仪抗体工作液，在2～8℃下孵育，时间为1h，加入显色液后避光反应6min，采用去离子水终止反应。阳性判定标准：①阴性对照孔斑点数量＜6时，抗原A孔或抗原B孔斑点数量-阴性对照孔斑点数量≥6；②阴性对照孔斑点数量≥6时，抗原A孔或抗原B孔斑点数量为阴性对照孔数量的2倍及以上。（2）ELISA法：使用上海酶联生物科技有限公司生产的试剂盒，检测方法：采集4ml静脉血，分别分装加入阴性培养基（基质液），测试抗原A培养基（ESAT-6），测试抗原B培养基（CFP-10）及阳性培养基（非特异性刺激源），将其放入37℃下孵育，22～24h后离心取血浆，按照50μL离心血浆+30μL稀释液比例加入包被鼠单克隆抗人γ干扰素抗体微孔板，将其放入37℃下孵育1h，再加入酶标抗体，继续孵育1h后进行冲洗，结束后加入显色液，避光反应15min，使用终止液终止反应。立即使用酶标仪测定各孔吸光（OD）值。阳性判定标准：OD值≥Cut off值，其中Cut off值=0.1+阴性对照孔平均OD值。

1.4 观察指标 所有患者经ELISPOT与ELISA法检测完成后，均行结核菌培养，以结核菌培养结果为“金标准”，对ELISPOT与ELISA法检测诊断结核病的效能进行分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS24.0软件进行数据处理，计数资料用百分比表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 结核菌培养结果 本研究80例患者中，结核菌培养结果中阳性74例，阴性6例。

2.2 两种检测方法诊断结核病的效能分析 以结核菌培养结果为“金标准”，ELISPOT诊断结核病的准确度为91.25%，灵敏度为91.89%，特异度为83.33%，阳性预测值为98.55%，阴性预测值为45.45%略高于ELISA法（86.25%、87.84%、66.67%、97.01%、30.77%），但经对比发现，差异不显著（P＞0.05）。见附表1、2。

3 讨论

感染结核菌后，患者可能会出现多系统症状，且不同系统感染，症状也有所不同，尤其感染早期，临床症状较为隐匿[4]。结核菌培养虽为结核病诊断的金标准，但由于该方法培养的时间较长，故延误患者治疗时间，导致其在临床中应用具有一定局限性[5]。因此，寻找一种快速、便捷的方法诊断结核病已成为临床关注的热点。

本研究结果显示，以结核菌培养结果为“金标准”，ELISPOT诊断结核病的准确度为91.25%，灵敏度为91.89%，特异度为83.33%，阳性预测值为98.55%，阴性预测值为45.45%略高于ELISA法（86.25%、87.84%、66.67%、97.01%、30.77%），但无明显差异，提示两种检测方式对结核病均有较好的诊断价值，但ELIAS法相比于ELISPOT对检测设备与操作方法要求较低，更适合在基层医院推广使用。分析原因在于，随着临床对免疫学研究不断深入，γ干扰素释放试验凭借其快速、灵敏度高、特异性强等优势在临床检验结核病中已取得重要地位[6]。目前，ELISPOT与ELISA法已成为γ干扰素释放试验中常用检测方法，且前者相比于后者具有更好的灵敏度与特异性[7]。ELISPOT与ELISA 法检测原理相似，即在纤维素薄膜外表吸附上抗原或抗体，维持其免疫活性，随后使其与酶标记物发生免疫反应，产生酶标记抗原抗体复合物，底物参与后结合物中的酶催化会逐渐氧化、水解，变成另一种带有颜色的物质沉着在复合物与纤维素薄膜外表吸附位置处，形成斑点，检测结果可依据斑点数量与色泽度判断[8][9]。

综上所述，ELISPOT与ELIAS法诊断临床诊断结核病均具有较高的临床价值，其中ELISPOT诊断准确度略高，但ELIAS法更适合在基层推广应用。