针刺通过调节DKK1通路调控骨代谢改善去卵巢模型大鼠骨质疏松的机制研究

乔梁，李珠华

(1.复旦大学附属中山医院徐汇医院中医科，上海 200030；2.福建省福清市医院康复医学科，福建福清 350300)

在我国，60～64岁之间的妇女骨质疏松症发生率为53.8%[1]。人口老龄化导致骨质疏松症的患病率不断上升，并发骨折的概率也越来越高，严重威胁着人类的健康和生命[2]。临床资料提示，Dickkopf-1(DKK1)参与骨髓间充质干细胞的成骨分化与成脂分化[3]。DKK1是Wnt信号通路的一种拮抗剂，已成为骨质疏松和骨关节疾病的研究热点[4]。研究显示，对于原发性骨质疏松性腰痛患者采取针刺治疗，可明显改善患者相关临床症状[5, 6]；另有研究证实，针刺刺激对于绝经后骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化有一定的促进作用[6]。因此，研究针刺如何通过调控DKK1基因抑制骨质疏松症、促进骨髓间充质干细胞成骨，具有重要意义。本课题应用去卵巢大鼠模型(ovariectomized rats,OVX)，根据“补肾生髓”、“筋骨并重”的理论基础，针刺“肾腧”穴位(双侧)，运用实验手段验证针刺对绝经后骨质疏松模型大鼠的治疗作用。本研究通过观察针刺治疗不同阶段的DKK1蛋白表达以及生物力学指标的影响，以期从信号和分子水平探讨针刺改善绝经后骨质疏松症的机制。有助于为该治疗方法的进一步临床应用奠定理论基础，为针刺治疗骨质疏松症的中医临床应用提供实验室证据，为中医针刺现代化研究探索合适的方法和模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6周龄SD雌性大鼠96只，SPF级，体重(180±20)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可SCXK(沪)2017-0005。

1.2 实验仪器以及试剂与药品

苏木素染液配置原料：苏木素、无水乙醇、硫酸铝钾、双蒸水、氧化汞、冰醋酸；盐酸-乙醇分化液：浓盐酸1 mL、70%乙醇99 mL；伊红液：伊红0.25～0.5 g、蒸馏水100 mL、冰醋酸1滴；抗体:DKK1、β-catenin、Wnt3a兔抗鼠多克隆抗体及即用型SABC免疫组化染色试剂盒 (南京博之约生物科技有限公司)。

1.3 实验仪器

无菌针灸针(材质：0Cr19Ni9奥氏体不锈钢)，规格：0.25 mm×13 mm，生产批号：津食药监械(准)字2005第2270003号 ；双能X线骨密度仪(Discovery Wi，美国HOLOGIC)；Instron生物材料实验机Electroplus E 1000 Test System；DPX-9052B电热恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)；RM2135超薄切片机(德国LEICA)；DHG-9140A电热恒温干燥箱(上海市跃进医疗器械厂)，BH-20光学显微镜(日本Olympus)；HI1210型摊片机(Leica，德国)；TP1020型全自动脱水机(Leica，德国)。

1.4 动物造模与分组

雌性SD大鼠共96只，其中80只采用经典的双侧卵巢切除进行原发性骨质疏松大鼠造模，造模术后随机分为5组：模型组16只，第一期针刺治疗组16只、第二期针刺治疗组16只、第三期针刺治疗组16只、阿伦磷酸盐阳性药物对照组16只。另16只行卵巢附近脂肪组织切除后，为空白对照组。各组大鼠均按每笼4只分笼饲养。

双侧卵巢切除术采用氯胺酮(0.1 g/kg)腹腔麻醉，取俯卧位，肋弓下第3-4腰椎处，剔净鼠毛，碘伏消毒，本手术要求无菌操作。手术首先经腰背侧路进入，切开皮肤后，将腰部筋膜和肌肉钝性分离，在充分暴露卵巢的情况下，结扎输卵管和周围血管，用眼科剪将卵巢切除。按相同的方法将对侧卵巢切除。确保卵巢切除干净，防止卵巢切除不干净及术后体重增加造成骨密度增加的不良结果。逐层缝合腹膜至皮肤，庆大霉素注射伤口。

1.5 干预方法

空白组和模型组术后不进行干预；各针刺治疗组采取针刺治疗，针刺双侧“肾腧”穴，定位严格按照《实验针灸学》第9版常用实验动物针灸穴位附图中的取穴方法，深度4～5 mm。第一期针刺治疗组在术后8周行针刺治疗，每日针刺一次；第二期针刺治疗组在术后10周针刺；第三期针刺治疗组在术后12周针刺；阿伦磷酸盐阳性药物对照组在术后8周开始服用阿伦磷酸盐，每周灌胃一次。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 应用双能X线(DXA)检测骨密度

在进行去卵巢手术后28周，对大鼠的全身及腰部骨密度值进行全面测量。测定时，将麻醉后的大鼠置于测定仪平台上，采用DISCOVERY双能X线骨密度仪及其所附带的骨密度测试配套采集与分析软件，对各大鼠的全身骨密度以及腰椎部分骨密度进行分析。

1.6.2 运用三点弯曲力学测试大鼠股骨生物力学参数

大鼠处死后，尽快将左侧股骨完整剥离，用眼科剪将肌肉等软组织剔除，剔除软组织的过程中注意保护骨膜，以0.9%氯化钠溶液浸泡，即刻完成三点弯曲力学测试。实验过程中，使用0.9%氯化钠溶液保持骨骼湿润，以降低干燥环境对骨力学性能的影响。检测指标包括股骨最大载荷力(F-max N)、股骨弹性模量(Stiffness N/mm)。

1.6.3 腰椎椎体的病理形态学H-E染色

大鼠处死后，将腰椎剥离，用眼科剪将肌肉等软组织剔除，注意保护骨膜，将样本以4%的多聚甲醛进行固定。固定后，继续进行EDTA脱钙处理。脱钙液每周更换2次，脱钙,1个月后进行修剪、组织切片。切片后，进行H-E染色，在光学显微镜下观察。

1.6.4 观察腰椎椎体Wnt3a、β-catenin、Dkk1的含量

取材、固定及脱钙同1.6.3，脱钙液每周更换2次，脱钙,1个月后进行修剪，修剪后进行组织切片。组织切片后，进行免疫组织化学染色，在光学显微镜下观察。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 针刺对OVX大鼠骨质疏松症状及骨量影响

各组大鼠在手术后28周时的骨密度情况见图1。与假手术组相比，OVX模型组、药物干预组、一期针刺治疗组、二期针刺治疗组、三期针刺治疗组的大鼠腰椎骨密度均出现显著下降(P<0.01)；药物干预组、一期针刺治疗组、二期针刺治疗组、三期针刺治疗组腰椎骨密度均高于OVX模型组(P<0.05)。

2.2 针刺干预对OVX大鼠生物力学功能的影响

各组大鼠在手术后28周时，胫骨的最大载荷力见图2(a)。与假手术组相比，其它各组大鼠胫骨最大载荷力均出现显著下降(P<0.01)；药物干预组、一期针刺治疗组、二期针刺治疗组、三期针刺治疗组的胫骨最大载荷力均高于OVX模型组(P<0.01)。各组大鼠在手术后28周时的胫骨弹性模量结果见图2(b)。与假手术组相比，各组大鼠胫骨弹性模量均出现显著下降(P<0.01)；药物干预组、一期针刺治疗组、二期针刺治疗组、三期针刺治疗组的胫骨弹性模量均高于OVX模型组(P<0.01)。

图1 大鼠全身骨密度

2.4 Wnt3a、β-catenin、Dkk1表达结果

利用免疫组织化学染色观察Wnt3a表达情况，见图4，OVX模型组的Wnt3a表达少于假手术组，药物干预组、一期针刺治疗组、二期针刺治疗、三期针刺治疗组的Wnt3a表达相较于OVX模型组有所增加。利用免疫组织化学染色观察β-catenin表达情况，见图5，OVX模型组相比假手术组的β-catenin表达减少，药物干预组、一期针刺治疗组、二期针刺治疗、三期针刺治疗组相比OVX模型组的β-catenin表达增加。利用免疫组织化学染色观察DKK1表达情况，见图6，OVX模型组相比假手术组的DKK1表达增加，药物干预组、一期针刺治疗组、二期针刺治疗、三期针刺治疗组相比OVX模型组的β-catenin表达减少。

图2

2.3 各组大鼠的H-E染色

假手术组骨细胞外形结构完整、呈扁椭圆形、多突起，胞质充满细颗粒状嗜碱性物质，核扁圆、染色深；骨小梁结构完整，厚度正常，密度正常。模型组：细胞外形出现明显的肿胀，细胞界限变得不甚清晰，胞浆呈现空泡样改变，核仁变淡或消失，同时骨小梁结构出现严重破坏，骨小梁厚度、密度明显降低。相较于OVX模型组而言，药物干预组、一期针刺治疗组、二期针刺治疗组、三期针刺治疗组的细胞肿胀和胞浆空泡样改变明显减轻，骨小梁结构的破坏情况明显改善(见图3)。

图3 H-E染色后的腰椎骨形态学改变情况(a.假手术组；b.模型组；c.药物干预组；d.一期针刺治疗组；e.二期针刺治疗组；f.三期针刺治疗组)

图4 腰椎骨Wnt3a表达情况 (a.假手术组；b.模型组；c.药物干预组；d.一期针刺治疗组；e.二期针刺治疗组；f.三期针刺治疗组)

图5 腰椎骨β-catenin表达情况(a.假手术组；b.模型组；c.药物干预组；d.一期针刺治疗组；e.二期针刺治疗组；f.三期针刺治疗组)

图6 腰椎骨Dkk1表达情况(a.假手术组；b.模型组；c.药物干预组；d.一期针刺治疗组；e.二期针刺治疗组；f.三期针刺治疗组)

3 讨论

研究显示，针刺刺激可以改善机体调节功能,升高内源性激素水平,帮助脾胃功能改善,加快患者机体对营养物质的吸收,改善骨密度,帮助患者骨质疏松症状得到有效改善[7, 8]。针刺治疗原发性骨质疏松症，可有效改善患者髋部和第2～4腰椎骨密度[9]。在生物力学角度，有研究结果显示针刺与推拿手法结合可以通过良性的应力刺激对腰椎生物力学结构进行有效调整，重建腰椎力学平衡，在防治骨质疏松症方面有重要的意义[10]。虽然有众多的前期研究结果对于针刺治疗的疗效给予了充分肯定，但疗效观测指标多为主观症状，不够客观、规范、统一，有关作用机理的研究报道较少。因此，学术界仍需探索一些客观的实验观察指标，以便于统一疗效判断标准。

Wnt信号转导途径是一组由配体蛋白Wnt和膜蛋白受体结合刺激的多下游信号转导途径。其中Wnt/β-catenin信号通路在骨代谢中起重要作用，信号通路中各种因子的表达水平变化会直接影响成骨细胞的生成和分化，促进骨祖细胞增殖，降低其成脂分化，同时减少成骨细胞凋亡，促进破骨细胞凋亡，从而导致骨形成增加[11, 12]。Wnt/β-catenin信号通路主要包括：配体(Wnt2，Wnt3等)，跨膜受体(LRP5/ 6和Frizzled家族分子)，细胞质调节蛋白(3-catenin，APC，Axin，GSK3B，Dsh等)。和核转录因子(TCF/ LEF1)等[11]。当Wnt信号通路被下调时，β-catenin与Axin、APC和GSK3B形成的复合物相互作用，进而导致β-catenin磷酸化。当Wnt信号通路上调时，Wnt蛋白与Frizzled和LRP5/6结合以促进细胞中分散蛋白(Dsh)的磷酸化。Dsh通过对GSK36的抑制延缓了β-catenin的磷酸化，从而导致β-catenin在细胞中逐渐积累。当细胞质中的β-catenin达到一定水平时，β-catenin从细胞质进入细胞核，并与T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)结合，调节骨靶基因Runx2、OPG等的表达，继而促进成骨细胞增殖并分化[13, 14]。

Dickkopf相关蛋白1(Dickkopf-related protein 1, DKK1)是由DKK1基因编码的蛋白质，该基因编码的蛋白质是Dickkopf家族的成员。Dkkl作为Wnt信号通路的抑制因子，抑制以上生物过程，调控下游通路，使间充质干细胞成脂分化、成骨细胞凋亡增加，影响骨形成[4]。DKK1主要参与Wnt/β-catenin 经典途径的机制，在于以下两个方面：一方面，DKK1能够在细胞外与Wnt蛋白辅助受体LRP5/6结合，此功能缺失突变表现为由骨形成降低所造成的骨量下降[15]；另一方面，DKK1可通过与含有Kringle结构域的Kremen受体(包括Kremen-1和Kremen-2) 结合，并与LRP5/6形成DKK1-LRP-Kremen三聚体，诱导细胞发生快速内吞，形成内吞小体，从细胞膜上除去LRP5/6，最终β-catenin被磷酸化而不能与核内LEF/TCF结合，从而抑制Wnt经典信号传导通路[16]。为揭示DKK1在骨骼发育方面的作用，有研究在小鼠体内构建了DKK1敲除模型，掲示了该基因的作用。由于颅骨缺损以及不完全发育，所有DKK1敲除纯合子的小鼠均在出生时死亡，该研究证实，DKK1对Wnt信号通路的抑制对于正确的骨骼发育至关重要[17]。与此同时，临床研究也提示，DKK1参与骨髓间充质干细胞的成骨分化与成脂分化[18]，DKK1作为Wnt信号通路的一种拮抗剂，如今已成为骨质疏松和骨关节疾病的研究热点[19]。

本实验研究结果表明，针刺干预后OVX大鼠的腰椎骨密度以及生物力学指标得到了明显改善。同时病理形态学显示，针刺干预后细胞肿胀和胞浆空泡样改变明显减轻，骨小梁结构的破坏情况明显改善。由此可以证明，针刺干预明显缓解了骨小梁的结构破坏，同时改善了骨骼的生物力学性能。骨强度是由骨质量和骨密度共同决定的，骨质量包含骨骼的组合构成及形态结构，当骨质疏松造成骨小梁机构破坏后，骨质量会相应出现下降。因此，在骨密度确定的情况下，骨骼的承重能力根据骨小梁结构的不同而变得不同。本研究结果显示，针刺治疗不仅改善了OVX大鼠的骨密度，同时改变了骨骼的生物力学性能，以及通过良性的应力刺激缓解了腰椎骨小梁结构的破坏，重建了腰椎力学的平衡，对于骨强度有明显改善作用，在防治骨质疏松症方面有重要意义。免疫组织化学染色显示，针刺干预后DKK1表达明显下降，β-catenin、Wnt3a表达明显增加 (P<0.01)。由此可见，针刺刺激“肾腧”穴后可能通过下调细胞因子DKK1，继而影响Wnt3/β-catenin信号通路，起到调节骨代谢的作用，从而有效地干预骨质疏松造成的骨质下降。