新型蒽醌类拓扑异构酶II抑制剂的深度学习设计与合成

沈泓佑, 何小妮, 鲁素芳, 秦 箐, 郝二伟, 刘 旭*

(1. 广西大学 a. 化学化工学院; b. 医学院，广西 南宁 530004； 2. 广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530299)

拓扑异构酶(Topoisomerase, Topo)为解DNA双螺旋中拓扑结构异常部分的酶。II型Topo可切割双螺旋的两条链而使超螺旋DNA解旋。同时拓扑异构酶II型通过磷-酪氨酸键与DNA裂解的两条链共价连接[1]。Topo II的抑制剂主要包括：鬼臼毒素类(依托泊苷、替尼泊苷等)、吖啶类和蒽醌类(阿霉素、米托蒽醌等)。其中，蒽醌类具有广泛生物活性，并且表现出独特的抗肿瘤作用[2]。但因严重副作用，如耐药性、继发性肿瘤和心脏毒性而临床应用受限[3-6]。因此，修饰其分子结构，提高药物生物利用度，降低对正常细胞的毒性，是亟待解决的实际问题。

大黄、茜草及芦荟等中药有一定抗肿瘤效果。其主要活性成份为具有蒽醌母核的大黄素、大黄酸及芦荟大黄素。目前临床上抗癌常用药阿霉素及米托蒽醌的基本母核也包含蒽醌结构[7]。蒽醌作为拓扑异构酶II抑制剂，可与拓扑异构酶II结合，阻断其对DAN复制的催化作用[8-10]。

本文根据文献和实验室前期工作[11-13]，收集整理了102个具有一定抗肿瘤活性蒽醌类衍生物。根据文献中IC50值和药理、毒性实验，以优、良、差和低毒、中毒、高毒标示其活性与毒性。以最新的深度学习算法作为建模工具，分别建立其结构特征与抗肿瘤活性、正常细胞毒性之间初步的定量构效关系模型(QSAR Model)[14]。在此基础上，运用拼合原理等基本思路，设计了91个新衍生物。计算新衍生物的结构特征，代入模型中，得到优活性衍生物37个，低毒性衍生物29个，同时具有优活性和低毒性的衍生物17个。又利用TOPO II作为受体靶标(PDB代码：1ZXM)，采用对接计算方法对17个新型1,4-二羟基蒽醌衍生物打分，取排名靠前且较易合成的化合物，以合适的方法进行合成与纯化，其结构经1H NMR，13C NMR和HR-MS(ESI)表征。最后进行了体外抗肿瘤药理和正常肝细胞L02毒理实验，对所得衍生物的抗肿瘤活性和毒性进行验证。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

WRS-1B型熔点仪；Bruker 600 MHz型核磁共振仪(TMS为内标)；UPLCI-CLASS-XEVOVG2-X型高效液相-质谱联用仪；Molecular operating Environment(MOE2010)软件包；蛋白晶体结构数据库(http:/www.rcsb.org/pdb)。

所用试剂均为分析纯或化学纯。

1.2 分子对接及QSAR建模

深度因子分解机(DeepFM)[15]为华为诺亚方舟实验室与哈尔滨工业大学开发的模型。其结构大体由三部分组成：嵌入层(Embedding Layer)，因子分解机(Factorization Machines)，深度神经网络(Deep Neural Net)。

图1 深度因子分解机(DeepFM)模型的主要层次和连接特点Figure 1 Main hierarchy and connection characteristics of deep factor decomposer model

本文共收集了102个具蒽醌母核结构的化合物(包括阿霉素及米托蒽醌)，以对不同肿瘤细胞的半数致死浓度IC50值为活性目标数据区分优、良、差三个活性区间。又以其对肝细胞等正常人体细胞的IC50值区分低毒、中毒、高毒。分子结构特征选取了成药五原则参数(氢键受体数，氢键给体数，分子量，油水分配系数，可旋转键数)，以及HOMO， LUMO能量值，水合能，分子体积和拓扑指数等作为训练参数(MOE软件包计算得到)，以DeepFM分别建立QSAR活性与毒性模型。根据经验，DeepFM隐藏层数设为16，每层隐藏节点数设为4。所得活性模型的留一法交叉验证准确率为83，毒性模型为80.7%。考虑到药物的生物利用度和降低毒性等方面，本文引入磺酰基和胺烷基结构设计了91个新型蒽醌衍生物。计算其结构特征并代入上述模型得到虚拟的抗癌活性和正常细胞毒性，取其中优活性和低毒性的交集，得到17个衍生物结构。

以TOPO II作为靶标对17个虚拟物再次筛选：以每化合物改变30次空间构型和靶标对接(MOE计算)，使用配体扩张法获得活性位点，采用柔性对接的方法，对接运行次数每个1000次，以LONDG为打分函数。取打分值低于-13.00部分，结果有11个衍生物达到较优分值标准。

1.3 合成

(1) 1-(2，4-二氟-5-氯苯磺酸酯)-4-苄胺-9,10蒽醌(B)的合成取1,4-二羟基蒽醌252.85 mg(1 mmol)溶于乙腈4.8 mL中，加热至回流，加入三乙胺0.74 mL和2,4-二氟-5-氯苯磺酰氯604.99 mg(2.4 mmol)，反应2 h。加入7.2 mL水，冷却至室温，析出淡黄色晶体，过滤，滤饼烘干得淡黄色粉末B，收率82%, m.p.178.0～178.6 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.13～8.01(m, 4H), 7.79(dd,J=5.8 Hz, 3.3 Hz, 2H), 7.67(s, 2H), 7.16(t,J=8.6 Hz, 2H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 180.13, 163.13, 161.39, 159.61,157.86, 145.87, 134.51, 133.11, 130.86, 126.93, 121.70, 117.96, 107.27; HR-MS(ESI)m/z: cacld 682.9130, found 682.9326{[M-Na]+}。

Scheme 1

(2) 1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-丙胺基-9,10蒽醌(B1～B11)的合成通法取B661.37 mg(1mmol)溶于27.4 mL二氯甲烷中，加入胺烷(NH2-R)约60 mg(约1 mmol)，搅拌下反应24 h。经硅胶柱层析[洗脱剂：V(二氯甲烷)/V(石油醚)=2/1]纯化得淡黄色固体(B1～B11)。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-丙胺基-9,10蒽醌(B1): 淡黄色固体299.53 mg，收率61%, m.p.160.8～160.9 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.08～8.03(m, 3H), 7.80～7.74(m, 2H), 7.65(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.61(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.13(t,J=8.5 Hz, 1H), 3.15(td,J=7.1 Hz, 5.0 Hz, 2H), 1.75(h,J=7.3 Hz, 2H), 1.04(t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.41, 180.23, 161.30, 150.55, 146.58, 145.52, 134.30, 134.15, 133.42, 133.14, 132.78, 131.08, 130.50, 128.47, 127.61, 126.95, 113.39, 108.98, 107.25, 97.85, 45.19, 22.00, 11.40; HR-MS(ESI)m/z: cacld 490.0406, found 490.0608{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-丁胺基-9,10蒽醌(B2): 淡黄色固体287.88 mg,收率57%, m.p.163.2～163.5 ℃;1H NMR(500 MHz, Chloroform-d)δ: 8.12～8.05(m, 3H), 7.83～7.77(m, 2H), 7.67(d,J=7.9 Hz, 1H), 7.64(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.16(t,J=8.6 Hz, 1H), 6.40(q,J=3.8 Hz, 3.3 Hz, 1H), 3.20(td,J=7.1 Hz, 4.9 Hz, 2H), 1.77～1.69(m, 2H), 1.53～1.44(m, 2H), 1.00(t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 180.41, 180.23, 161.14, 150.63, 146.58, 145.52, 134.29, 134.15, 133.43, 133.14, 132.78, 131.08, 130.50, 128.47, 127.61, 126.95, 113.37, 108.94, 107.25, 97.81, 43.23, 30.74, 20.10, 13.75; MSm/z: cacld 504.0562, found 504.0742{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-戊胺基-9,10蒽醌(B3): 淡黄色固体285.49 mg,收率55%, m.p.164.5～164.8 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.09～8.03(m, 3H), 7.81～7.75(m, 2H), 7.65(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.61(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.13(t,J=8.6 Hz, 1H), 3.17(td,J=7.2 Hz, 4.9 Hz, 2H), 1.73(p,J=7.2 Hz, 2H), 1.39(tdd,J=15.5 Hz, 7.7 Hz, 2.7 Hz, 4H), 0.92(t,J=6.9 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 180.54, 180.35, 161.26, 150.74, 146.70, 145.64, 134.41, 134.27, 133.55, 133.27, 132.89, 131.20, 131.12, 130.62, 128.59, 127.73, 127.08, 113.49, 107.37, 97.93, 43.64, 29.16, 28.53, 22.46, 14.07; MSm/z: cacld 518.0719, found 518.0725{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-己胺基-9,10蒽醌(B4): 淡黄色固体266.54 mg,收率50%, m.p.168.1～168.4 ℃;1H NMR(500 MHz, Chloroform-d)δ: 8.05(dddd,J=13.0 Hz, 8.3 Hz, 5.3 Hz, 3.2 Hz, 3H), 7.82 ～7.74(m, 2H), 7.64(d,J=7.9 Hz, 1H), 7.61(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.13(t,J=8.6 Hz, 1H), 6.38(td,J=5.0 Hz, 2.0 Hz, 1H), 3.16(td,J=7.2 Hz, 5.0 Hz, 2H), 1.71(p,J=7.3 Hz, 2H), 1.46～1.38(m, 2H), 1.36～1.24(m, 4H), 0.93～0.85(m, 3H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 180.41, 180.23, 161.14, 150.62, 146.58, 145.51, 134.29, 134.14, 133.43, 133.15, 132.77, 131.07, 130.50, 128.47, 127.61, 126.96, 113.36, 108.95, 107.24, 97.82, 43.55, 31.68, 28.92, 26.88, 22.57, 14.06; MSm/z: cacld 532.0875, found 532.0817{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(3-甲氧基丙胺基)-9,10蒽醌(B5): 淡黄色固体218.84 mg,收率42%, m.p.161.3～161.5 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.09～7.99(m, 3H), 7.76 ～7.71(m, 2H), 7.69(d,J=6.8 Hz, 1H), 7.60(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.12(t,J=8.6 Hz, 1H), 3.55(t,J=5.4 Hz, 2H), 3.38(s, 3H), 3.25(q,J=5.9 Hz, 2H), 1.96～1.91(m, 2H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.43, 180.24, 161.36, 150.99, 146.62, 145.49, 134.29, 134.11, 133.45, 133.15, 132.77, 131.07, 130.46, 128.52, 127.60, 126.97, 113.50, 108.41, 107.24, 97.47, 71.43, 58.93, 42.40, 28.27; MSm/z: cacld 520.0511, found 520.0428{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(3-乙氧基丙胺基)-9,10蒽醌(B6): 淡黄色固体214.02 mg,收率40%, m.p.151.4～151.8 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ8.09～8.00(m, 3H), 7.76 ～7.72(m, 2H), 7.69(d,J=6.8 Hz, 1H), 7.60(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.12(t,J=8.6 Hz, 1H), 3.60(t,J=5.3 Hz, 2H), 3.51(q,J=7.0 Hz, 2H), 3.24(q,J=5.7 Hz, 2H), 1.98～1.92(m, 2H), 1.24(t,J=7.0 Hz, 3H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.43, 180.24, 159.32, 151.04, 146.63, 145.49, 134.29, 134.10, 133.45, 133.14, 132.78, 131.08, 130.45, 128.54, 127.60, 126.97, 113.50, 108.25, 107.24, 97.42, 69.68, 66.83, 42.82, 28.33, 15.25; MSm/z: cacld 534.0668, found 534.0628{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(3-苯基丙胺基)-9,10蒽醌(B7): 淡黄色固体215.48 mg,收率38%, m.p.163.5～163.7 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.00(td,J=8.5 Hz, 7.3 Hz, 4.9 Hz, 2H), 7.84～7.77(m, 3H), 7.65(d,J=1.5 Hz, 2H), 7.37(d,J=7.0 Hz, 1H), 7.30(dd,J=8.3 Hz, 6.9 Hz, 2H), 7.22～7.18(m, 3H), 3.15～3.08(m, 2H), 2.58(t,J=7.7 Hz, 2H), 1.73～1.66(m, 2H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.40, 180.22, 161.26, 150.47, 146.56, 145.52, 140.43, 134.29, 134.16, 133.41, 133.13, 132.76, 131.07, 130.49, 128.74, 128.45, 128.34, 127.62, 126.93, 126.78, 126.48, 113.42, 109.06, 107.25, 97.65, 77.30, 42.77, 33.01, 30.01; MSm/z: cacld 566.0719, found 566.0738{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(3,3-二苯基丙胺基)-9,10蒽醌(B8): 淡黄色固体276.53 mg,收率43%, m.p.171.2～171.4 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.01～7.95(m, 2H), 7.77～7.71(m, 3H), 7.63(s, 2H), 7.35(d,J=7.0 Hz, 1H), 7.32～7.26(m, 8H), 7.18(tp,J=5.9 Hz, 3.1 Hz, 2H), 4.00(t,J=7.7 Hz, 1H), 3.03～2.97(m, 2H), 2.17(q,J=7.9 Hz, 2H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.40, 180.23, 161.22, 150.27, 146.55, 145.51, 143.52, 134.29, 134.17, 133.40, 133.13, 132.76, 131.04, 130.49, 128.88, 128.44, 127.62, 126.93, 126.85, 126.78, 113.45, 109.18, 107.25, 97.89, 48.89, 42.14, 34.38; MSm/z: cacld 642.1032, found 642.1124{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(3-吗啉基丙胺基)-9,10蒽醌(B9): 淡黄色固体195.87 mg,收率34%, m.p.143.1～143.3℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.12～8.05(m, 3H), 7.83 ～7.77(m, 2H), 7.64(d,J=8.6 Hz, 2H), 7.16(t,J=8.6 Hz, 1H), 3.76(t,J=4.6 Hz, 4H), 3.32(q,J=6.4 Hz, 2H), 2.49(dd,J=15.7 Hz, 9.2 Hz, 6H), 1.91(p,J=6.6 Hz, 2H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.40, 180.16, 162.15, 148.34, 146.09, 145.73, 134.50, 134.45, 133.33, 133.21, 132.74, 131.16, 130.71, 128.60, 127.70, 126.95, 126.84, 111.82, 107.27, 107.13, 100.35, 77.29, 66.81, 56.13, 53.81, 42.18, 25.27; MSm/z: cacld 575.0933, found 575.0914{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(4-氨基丁醛二甲缩醛基)-9,10蒽醌(B10): 淡黄色固体231.68 mg,收率41%, m.p.134.2～134.5 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.11～8.03(m, 3H), 7.78 ～7.75(m, 2H), 7.73(d,J=6.8 Hz, 1H), 7.63(d,J=9.1 Hz, 1H), 7.15(t,J=8.6 Hz, 1H), 4.43(t,J=4.9 Hz, 1H), 3.39(s, 6H), 3.20(q,J=6.2 Hz, 2H), 1.76(pt,J=7.2 Hz, 3.8 Hz, 4H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.42, 180.25, 161.30, 150.65, 146.58, 145.51, 134.32, 134.16, 133.42, 133.14, 132.77, 131.05, 130.49, 127.62, 126.96, 126.77, 113.43, 108.99, 107.25, 104.19, 97.86, 53.42, 43.34, 29.87, 23.39; MSm/z: cacld 564.0774, found 564.0618{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(3-(二丁胺)丙胺基)-9,10蒽醌(B11): 淡黄色固体296.72 mg,收率48%, m.p.100.6～100.8 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.10～8.00(m, 3H), 7.73(dd,J=5.8 Hz, 3.3 Hz, 2H), 7.67(d,J=6.9 Hz, 1H), 7.60(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.12(t,J=8.6 Hz, 1H), 3.21(q,J=5.5 Hz, 2H), 2.60(s, 2H), 2.45(t,J=8.0 Hz, 4H), 1.81(s, 2H), 1.45(p,J=7.8 Hz, 4H), 1.29(h,J=7.4 Hz, 4H), 0.91(t,J=7.3 Hz, 6H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.46, 180.26, 159.34, 151.43, 146.70, 145.45, 134.26, 134.07, 133.49, 133.16, 132.79, 131.03, 130.88, 130.42, 128.57, 126.99, 126.74, 113.54, 107.23, 97.10, 54.04, 53.49, 44.28, 28.55, 24.75, 20.85, 14.09; MSm/z: cacld 617.1767, found 617.1723{[M-H]-}。

1.4 生物活性测试

使用MTS法测定所有化合物对DU-145、 HELA、 HEPG-2癌细胞系和正常肝细胞L02的体外细胞毒性。以1,4-二羟基蒽和5-FU为对照。

2 结果与讨论

2.1 生物活性

表1为目标化合物的体外细胞毒性。由表1可知，与1,4-二羟基蒽醌相比，B1～B11的抗癌活性明显增强，尤其是B6和B11对DU-145具有显著的抑制作用，其IC50分别为16.88 μM和5.48 μM。

表1 化合物的体外抗肿瘤活性*Table 1 In vitro antitumor activities

表2 化合物的分子对接结果Table 2 The molecular docking results

图2 化合物B11与拓扑异构酶II的相互作用Figure 2 Interactions of B11 and Topo II

2.2 分子对接分析

分子对接结果见表2，以化合物B11为实例，对其与Topo II受体的结合相互作用进行分析，结果见图2。由表2和图2可知，B11与DNA拓扑异构酶II的结合吉布斯自由能为-16.06 kcal/mol，优于醌茜(-7.11 kcal/mol)；从口袋形状看，B11能较好地与Topo II活性位点吻合；其拓展取代基团通过氢键相互作用与口袋内的两个氨基酸残基(Asn B91和Tyr A34)有强关联；蒽醌的刀片式平面有利于切入与Topo II作用的DNA链中。

以QSAR模型和对接计算为基础，设计并合成了11个蒽醌衍生物(B1～B11)。体外活性测试结果表明，活性最佳的化合物为B11，对DU-145的IC50为5.48 μmol/L。并结合药理实验和对接图，对B11与靶点的相互作用进行分析，阐述了其可能的分子机制。