Toll样受体信号通路在两栖类中的研究进展

许 晴 吴晨薇 李义军 张晶钰 柴龙会 肖向红 郝 丽

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

1 两栖动物生存现状

两栖类(Amphibia)动物隶属脊索动物门(Chordate)，脊椎动物亚门(Vertebrata)，是脊椎动物由水生向陆生的过渡类群，在地球上生存了3亿多年，进化地位重要[1]。两栖类躯体结构和机能以及行为等方面还不能很好地适应陆地环境，幼体在水中发育、成体水生或水陆兼栖的生活方式、体温不能保持恒定的生物学特性限制了其生存和分布，故而两栖类是脊椎动物中种类和数量较少的一个类群[1]。现代两栖类皮肤裸露、腺体丰富，具有独特的生活史周期，相对于其他陆生脊椎动物其对环境变化更为敏感，常作为环境指示生物[2]。1989年，在世界第一届爬虫学大会上，科学家们提出全球两栖类种群呈现出衰减的趋势，该现象也在随后的研究中被证实并得到广泛的关注[3]。目前，两栖类动物种群数量的减少已经成为一个全球性的问题[4]，世界自然保护联盟全球两栖类评估(GAA)结果显示：近几十年间，世界上近三分之一(32.5%，1 856种)的两栖类物种受到威胁，至少2 469(43.2%)种两栖类物种数量正在减少[5]。江建平等[6]2016年对中国408种两栖动物的濒危状况最新评估结果显示：中国两栖动物1种灭绝，1种区域灭绝，受威胁的物种共计176种，占评估物种总数的43.1%。

造成两栖类受威胁现状的原因有多种，如紫外辐射的增加、全球气候变迁、流行性疾病的爆发、生境破碎化、环境污染、人为过度捕捉和生物入侵等。以上多种因素相互作用加速了两栖类种群数量的衰减。其中，有研究证明栖息地的丧失和真菌、病原微生物感染引起的疾病的流行是两栖动物种群衰退的重要原因[7]。传染病的流行会迅速导致两栖类大规模的死亡，主要由细菌、真菌和病毒感染所致。1974—1982年，由于嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila，Ah)的感染导致了美国科罗拉多州当地的一种蟾蜍(Bufoboreasboreas)种群数量大规模下降；1981年，同样是由于Ah的感染，美国罗德岛州木蛙(Ranasylvatica)卵几乎灭绝，造成该地区3年后没有成年木蛙在当地繁殖[7]。在澳大利亚和巴拿马，从濒死的无尾目(Anura)动物上分离出来的一种真菌——壶菌(Batrachochytriumdendrobatidis)，其定植于角质化的上皮，也会导致蛙类的大面积死亡[8]。20世纪60年代，在蝌蚪期的豹蛙(Ranapipiens)中发现一种可以感染多种两栖类动物的病毒，即蛙虹彩病毒(Ranagryliovirus，RGV)，由于其高致病性和高致死率，被世界卫生组织列为必须申报的水生动物传染病[9]，国内外报道了多起虹彩病毒感染两栖类、鱼类以及爬行类动物的事件，导致了大规模传染性疾病的爆发[10-11]。Pounds等[12]的研究发现两栖类种群中一些病原微生物的爆发与全球气候变暖有关，极端气候事件通过促进诸如壶菌类病原体的爆发而导致两栖类种群数量的迅速下降。此外，许多致病微生物存在于健康的个体上，这些微生物可能帮助两栖类抑制体表致病真菌的生长，如蛙壶菌，但当个体的免疫系统遭到破坏时，疾病就会发生，大部分的条件性致病菌即是如此[13]。所以许多生物学家认为，两栖类动物疾病的传播可能与环境的胁迫作用、免疫抑制、内分泌失调、寄主的变异以及传播方式的改变有关[4，14]。

2 两栖类免疫系统

生物在长期的演化过程中逐渐进化出一套能够识别并抵御病原体入侵的免疫防御系统。两栖类动物的免疫系统与哺乳动物类似，主要包含先天性免疫和获得性免疫[15]。

2.1 两栖类先天性免疫

先天性免疫作为机体抵御病原微生物的第一道防线，反应迅速，在机体发育过程中尤其是获得性免疫未完善之前起到重要的防御作用。脊椎动物主要是通过效应细胞上的模式识别受体(PRRs)识别病原体上保守的病原相关分子模式(PAMPs)，来激活免疫级联反应，促使机体释放多种可溶性介质以抵御病原菌的侵染，为机体提供最快速直接的免疫效应[16-17]。目前，对于两栖类先天性免疫关注和研究最多的是皮肤活性肽的作用。在长期的进化过程中两栖类皮肤担任起调节水平衡、呼吸、抵抗猎食者、抗菌抗病毒、外分泌、调节温度、繁殖、逃避等多方面功能，以适应多样的环境变化，保持自身稳态平衡，是两栖类免疫防御的第一道防线。两栖类的皮肤可以分泌丰富的具有高度生物活性的分泌物，主要包括生物胺、生物碱、蟾蜍配基、多肽和蛋白质4大类生物化学成分[18]，其中数量最多种类最丰富的是生物活性肽和生物胺，据估计两栖类皮肤中含有超过10万种生物活性化合物[19]。两栖类皮肤活性肽平时储存于皮肤颗粒腺中，在机体受到压力或受伤时可以高浓度地释放到皮肤分泌物中发挥作用，目前根据两栖类皮肤活性肽的功能可分为抗菌肽、抗病毒肽、抗肿瘤肽、抗寄生虫肽、肌肽、阿片肽、免疫调节肽、伤口愈合肽、血管紧张素样肽等近20多个类别，功能涉及抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、抗肿瘤、控制血压、调节水盐平衡、控制平滑肌收缩、镇痛、促进伤口愈合、调节免疫细胞功能和细胞因子的合成等多个方面[19]，具有开发为药物的巨大潜力，在临床方面的应用也越来越受关注。潮湿的生活环境和裸露皮肤使两栖类处于复杂的微生物环境之中，两栖类皮肤分泌的抗菌肽相互之间协同作用能够有效抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌以及某些耐药菌的定殖，具有广谱的抗菌活性，且由于其特殊的作用原理使微生物不易产生抗性[18]。此外，当病原微生物入侵到机体内后，两栖类血液和组织内的巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞可以直接吞噬抗原微生物[20]。研究发现，蛙类的红细胞也具备吞噬入侵病原体的功能[20]。

2.2 两栖类获得性免疫

两栖类获得性免疫包括细胞免疫和体液免疫。以无尾目蛙科(Ranidae)动物为例，蛙类中参与获得性免疫的主要是来源于胸腺和脾脏的淋巴细胞，相较于鱼类，蛙类的淋巴细胞已有了进一步的分化，可以分为T淋巴细胞和B淋巴细胞。T淋巴细胞主要参与细胞免疫，蝌蚪期主要在脾脏中产生，成体中在外周血的分布明显高于胸腺、脾脏、肾脏和肝脏等器官[21]，具有直接杀伤细胞、通过分泌细胞因子调节免疫反应的作用。B淋巴细胞参与体液免疫，胚胎及幼体时期主要在肾脏中形成，而后骨髓也参与形成，在抗原刺激下B淋巴细胞转化为浆细胞并产生特异性抗体参与免疫反应[21]。蛙类免疫系统的能力呈现出季节性变化，冬眠时淋巴器官与循环系统淋巴细胞的数量明显减少，且淋巴细胞的分裂和增殖能力减弱，对抗原的识别能力下降，免疫力减弱，随后随着气温的上升免疫能力逐渐增强[22]。获得性免疫的启动通过细胞免疫和体液免疫，过程涉及细胞增殖、基因的激活和蛋白质的合成等生理过程，且需要预先接触抗原和一定的时间激活，所以获得性免疫相较于先天性免疫的速度更慢，但具有更严格的特异性和针对性[23]。

包括两栖类在内的低等脊椎动物虽然已经具备获得性免疫，但该获得性免疫涉及多种生物学过程，反应速度较慢，往往不足以迅速消灭病原体，先天性免疫则提供了更快速的免疫防御机制，在机体对于病原体的早期应答中发挥重要作用[24]。Zhao等[25]对大蹼铃蟾(Bombinamaxima)的血液和皮肤进行转录组测序，发现B.maxima具有强大且健全的先天性免疫系统。黄丽[26]分析12种两栖动物免疫相关基因的表达情况结果显示两栖类先天性免疫基因数目要远远大于获得性免疫基因。一直以来，先天性免疫被认为是非专一性的识别病原微生物，但20世纪90年代模式识别受体(PRRs)Toll样受体的发现表明先天性免疫同样可以专一性的识别病原微生物[27]。

3 Toll样受体(TLR)

“Toll”一词最初是指早期果蝇(Drosophila)幼虫中控制背腹方向的细胞表面受体[28]，随后Lemaitre等[29]发现Toll在果蝇成体中发挥有效的抗真菌反应；1991年，Gay等[30]在哺乳动物中发现IL-1受体的胞质部分与果蝇Toll蛋白结构具有同源性，提示Toll可能具备的免疫学功能；1996年，Hoffman发现果蝇受到病原微生物的侵袭时，Toll信号通路会被激活并参与调节免疫基因的表达[31]；1997年，Medzhitov等[32]发现了与果蝇Toll受体同源的Toll样受体4，并将类似于Toll蛋白的受体命名为Toll样受体，即TLR。TLRs在各种脊椎动物中的数量因类群的不同而不同。目前，TLRs在哺乳动物中的研究最为广泛，在哺乳动物中至少已经发现13种tlr基因，分别被命名为tlr1-tlr13，其中人类基因组中已鉴别出tlr1-tlr1010种tlr基因，小鼠中鉴别出除tlr10之外的tlr1-tlr13中的12种基因，其中tlr11-tlr13为小鼠特有[33]；在鱼类中共发现23种，鸟类中发现10种。对于两栖类和爬行类tlr家族成员的研究还比较少，除了发现与哺乳动物tlr基因的直系同源物，目前只在两栖类非洲爪蟾(Xenopuslaevis)和部分爬行动物中发现tlr14基因，在非洲爪蟾中还发现了tlr16基因[34]。

TLRs属于I型跨膜蛋白，由富含亮氨酸重复序列胞外域(LRRs)、跨膜区域和包内的TIR结构域3部分组成。TLRs广泛表达于各类免疫细胞，如单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞等[35]。当机体遭到病原体的侵袭时，TLRs可刺激这些天然免疫细胞分泌大量细胞因子、趋化因子等调节感染部位免疫细胞的迁移，诱导炎症反应的发生，同时促进与吞噬相关的基因(MACRO、SR-A、CD36、LOX-1等)的表达，增强巨噬细胞、中性粒细胞的吞噬能力，从而增强对病原体的清除能力[35]。此外，TLRs也大量表达于上皮和内皮细胞，如呼吸道、肠上皮、血管内皮和泌尿道生殖上皮等先天性免疫的第一道防线。对病原体的先天性免疫启动的一个关键因素是识别病原体上常见的、宿主体内通常不存在的成分，即病原相关分子模式(PAMPs)，主要包括脂多糖(LPS)、病毒双链RNA(dsRNA)、肽聚糖(PGN)、酵母多糖、脂磷壁酸(LTA)和细菌DNA等[36]。TLRs可通过胞外的LRRs结构来识别不同的PAMPs，被激活后的TLRs通过胞内的TIR结构域和含有相同结构域的接头蛋白相互作用，激活下游信号。

TLRs信号通路可以分为MyD88介导的信号通路和非MyD88介导的信号通路。以哺乳动物TLRs信号通路为例，TLR1、2、5、6、7、9、11、12由MyD88介导的信号通路转导，TLR3 由非MyD88介导的信号通路转导，TLRs可由MyD88介导也可不依赖MyD88介导(图1)[37]。在MyD88介导的信号通路中，活化的MyD88募集IRAKs，然后与接头分子肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF6形成转导复合体，激活的TRAF6进一步激活IκB激酶，活化的IκB激酶磷酸化IκB，释放重要的核转录因子NF-κB，NF-κB在其核定位信号序列的引导下进入到细胞核内，结合到靶基因的启动子上启动靶基因的转录表达，最终释放炎性因子完成免疫应答。在MyD88非依赖途径中，TLR3和TLR4识别配体后以TRIF作为接头分子，所以该途径又称为TRIF依赖途径，TLRs与TRIF结合后招募并激活TRAF6或TRAF3，促使IRF3、IRF7二聚体以及NF-κB激活并进入细胞核内，启动靶基因的转录[38]。

TLRs不仅在先天性免疫中起到识别病原激活天然免疫细胞、诱导免疫细胞向感染部位迁移、激活下游免疫级联反应诱导一系列炎性介质的产生等作用，对获得性免疫也起到重要的调控作用，是沟通先天性免疫和获得性免疫的桥梁[39]。首先，TLRs可激活T淋巴细胞和B淋巴细胞，在启动获得性免疫中发挥作用。研究发现，DCs是最有效的抗原呈递细胞(APC)，未成熟的DCs高表达与吞噬相关的受体，摄取和加工处理抗原的能力较强，而成熟的DCs提供的共刺激信号协同抗原刺激信号在淋巴细胞的激活中起重要作用，由微生物引起的DCs的成熟需要TLRs的参与，TLRs识别配体后促使DCs成熟并高表达共刺激分子(CD40、CD80、CD86等)，同时上调IL-6等因子的表达来抑制调节性T细胞的活性[40]，进而迁移至淋巴器官介导T淋巴细胞的激活[41-42]。除表面共刺激分子外，TLRs激活后DCs释放的促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12等)和趋化因子(VCAM等)均增加，这些变化不仅可以招募中性粒细胞、巨噬细胞等先天性免疫细胞聚集至感染部位，还可以诱导适应性免疫[43]，所以DCs也是TLRs连接先天免疫与获得性免疫的纽带细胞。B细胞的激活同样需要TLRs的参与，Pasare等[44]的研究发现B细胞表达T细胞依赖型抗体不仅需要激活CD4+T细胞，还需要TLRs激活B细胞。其次在T细胞分化过程中，TLRs可参与调节Th1/Th2细胞间的平衡，并在机体初次免疫时记忆性T细胞的分化中发挥作用。抗原刺激活化后的DCs可分泌不同细胞因子促使T细胞分化为Th1、Th2等效应细胞，TLRs是决定DCs分泌细胞因子类型的重要因素之一，例如TLR9与配体结合可促使DCs分泌Th1型细胞因子(IL-12、IFN-γ等)，TLR2与配体结合可促使DCs分泌Th2型细胞因子(IL-4等)，分别诱导T细胞向不同方向分化[36]。机体T细胞向记忆T细胞的分化过程也需要TLRs的参与，机体初次启动对某种抗原的免疫应答时，T细胞会分化成为记忆性T细胞和效应T细胞，Pasare等[45]的研究发现MyD88基因缺陷型小鼠在初次受到脂多糖刺激时，尽管暂时抑制调节性T细胞可以恢复T细胞的免疫应答，但无法形成记忆性T细胞，表明记忆性T细胞的形成可能需要TLRs介导的信号参与。此外，TLRs还可诱导DCs产生I型干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-ε和IFN-λ)，I型干扰素在抗病毒方面发挥重要作用，同时在促进获得性免疫中也起到重要作用[36]。

4 两栖类TLRs研究进展

4.1 两栖类TLRs的进化及同源性分析

2007年，Ishii等[34]完成了两栖类模式生物非洲爪蟾的全基因组测序工作，并通过同源搜索的方式得到了爪蟾基因组中23个含TIR结构域的分子序列，其中19个分子在进一步同源性比对分析中被确认为爪蟾tlr(xtrtlrs)。序列比对结果表明，两栖类TLR基因库中既具备与鱼类相似的tlr(tlr14、tlr21-tlr23)又具备哺乳类tlr(tlr6、tlr10-13)，tlr1-5、tlr7-9为鱼类、哺乳类和以爪蟾为代表的两栖类共有的tlrs。Ishii等[34]认为tlr系统在进化过程中所表现出来的物种差异性和生物的生活环境有关，两栖类具备适应水生环境和陆地环境的tlr。

张磊[46]从已发表的两栖类基因组中鉴定出来的tlr基因序列为种子序列，从组装的转录组中对tlr进行鉴定，共鉴定得到涉及3个目17个科的401条tlr基因序列。根据两栖类和脊椎动物系统发育树分析发现两栖类Toll样受体的基因数量在鱼类和陆生脊椎动物之间，此外大多数tlr基因在有尾目(Caudata)和无尾目各聚为一支，表明在“目”的水平上，两栖类动物tlr基因的同源性比较高；在tlr1、tlr2、tlr5l、tlr22的系统发育树中，有尾目和蚓螈目(Gymnophiona)聚为一支，反而和亲缘关系较近的无尾目更远，这可能和环境的胁迫条件有关，有尾目和蚓螈目面对更相似的病原菌环境；对两栖类TLR蛋白的三维预测结果显示，所有蛋白都含有一个三维马蹄型结构，特殊的是TLR5L缺乏介导下游信号转导的胞内域结构(TIR结构域)，而硬骨鱼中同为TLR5家族的TLR5S同样缺少胞内域，暗示两栖类tlr5l基因的起源可能和硬骨鱼中tlr5s有直接的关系。该研究结果也证明两栖类tlr基因家族的组成介于鱼类和哺乳动物之间，反映了水生和陆生环境的关联。而在目前的研究中，已知的两栖类tlr4基因仅存在于无尾目动物中[47]，有尾目中还未发现该基因，这可能是因为在进化过程中有尾目的祖先基因发生了丢失；Babik等[48]的研究发现，tlr19在有尾目蝾螈中存在而同样未在爪蟾中发现。tlr基因的数量在脊椎动物不同的类群中变化较大，其中不乏许多tlr基因出现复制和丢失的现象，如鸟类tlr2a和tlr2b可能是其他脊椎动物tlr2复制产生的，tlr15为鸟类和部分爬行类特有。这种现象的出现可能和脊椎动物的生活方式有关，为了适应不同的生境，tlr基因的数量在进化中发生适应性的扩张或缩小[49]。选择压力分析结果表明两栖类的tlr基因普遍受到正选择作用，且检测到的正选择位点位于胞外LRR区，该区域为抗原结合区主要负责识别病原菌的病原相关分子模式，而无尾目tlr基因中检测到的正选择位点远多于有尾目，表明无尾目tlr基因受到更强烈的正选择作用[46]。

4.2 两栖类TLRs在不同发育阶段的差异性表达

以蛙类为代表的两栖类虽然有着与哺乳动物相似的获得性免疫系统，但在早期完成变态发育之前其获得性免疫系统发育并不完善，例如蝌蚪时期负责识别抗原并呈递给免疫T细胞的主要组织相容性复合体(MHC)I类表达水平低，MHC Ⅱ类几乎不表达[34]。个体暴露于复杂的水环境之中，直接接触多种病原微生物，但这并不影响大部分的蝌蚪发育成健康的成体，表明先天性免疫系统在蝌蚪抵御病原微生物的侵袭中发挥重要作用。

Ishii等[34]发现tlr基因在非洲爪蟾蝌蚪和成体时期皮肤、心脏、肠道、肝脏、肾脏和卵巢中广泛表达，说明先天性免疫防御系统中的TLRs在爪蟾蝌蚪时期能够有效识别和清除病原体。王泽等[28]用RT-PCR半定量实验发现11-42期的东北林蛙(Ranadybowskii)蝌蚪TLR2 mRNA的表达随发育时期呈波动变化，这也与其处于不同发育阶段时的生境变化相适应：脱膜前后的蝌蚪获得性免疫不完善，TLR2的表达量也呈现出持续性的升高，直至第25期蝌蚪鳃盖闭合时达到峰值，此时的蝌蚪体液免疫已初具规模；蝌蚪发育至42期，获得性免疫趋于完善，此时TLR2 mRNA的表达也相对稳定。此外，作者还用脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、酵母多糖A(ZymonA)和聚肌胞苷酸(Ploy I：C)腹腔注射处于不同发育时期的蝌蚪，分别模拟革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌和病毒的急性感染。结果显示在LTA和Ploy I：C刺激下，TLR2 mRNA显著升高，24 h内未对脂多糖和酵母多糖A产生显著反应，证明东北林蛙TLR2可以识别入侵机体的革兰氏阳性菌和病毒并作出应答。哺乳动物的TLR2无法识别病毒的dsRNA及其类似物Ploy I：C[50]，而鱼类则对4种病原相关分子都有识别，所以林蛙的TLR2配体识别兼具鱼类和哺乳类的特征[28]。我们发现，从鱼类到两栖类，再到哺乳类，TLR2的PAMPs识别谱系逐渐减少，暗示在进化过程中TLR2的配体识别功能可能发生了一定程度的特化。

在温带或寒带地区分布的两栖类通常会选择在陆地或水下冬眠度过漫长的冬季，这也是变温动物经过长期进化演化出的保存体能、避开寒冷、饥饿和疾病等不利条件的自我保护方式[51]。两栖类免疫系统具有温度依赖性，冬眠时长期处于低温条件下会使两栖类代谢水平下降，淋巴细胞的增殖分化能力减弱，机体免疫机能下降，而低温除了会使两栖类机体免疫能力下降外，同时限制病原微生物的增殖，从而使病原微生物与宿主达到相对平衡的状态[51]。研究发现，两栖类同样会使用另一种策略提高冬眠期的存活率，就是在恶劣条件来临之前就提高自身免疫功能。席丽琴[52]通过免疫组织化学染色、免疫印迹、实时定量PCR和酶联免疫吸附等实验技术手段研究了繁殖期和冬眠前期东北林蛙皮肤组织中Toll受体通路中重要分子TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB和主要细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-1R1的表达。结果显示，冬眠前期和繁殖期林蛙皮肤组织中TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB在mRNA和蛋白水平均有表达，且主要表达于东北林蛙上皮细胞和真皮中的腺细胞，其中MyD88、NF-κB免疫阳性信号更强，且重要的核转录因子NF-κB mRNA和蛋白水平在林蛙冬眠期前的表达均显著高于繁殖期前。炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-1R1主要定位于上皮细胞和真皮中的腺细胞，且IL-1R1的阳性信号更强，表明东北林蛙皮肤自身可以合成IL-1β；蛋白水平上，除IL-1β外，其他细胞因子在冬眠前期的表达均高于繁殖期，表明进入冬眠期前林蛙皮肤的免疫功能在一定程度上增强。该结果表明，林蛙在进入冬眠期前，皮肤表达IL-6、TNF-α和IL-1R1增加，免疫功能提高，是机体作出的用以应对冬眠期恶劣环境的适应性变化；TLRs信号通路中TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB在林蛙皮肤均有表达，表明细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α很可能是通过TLRs、NF-κB信号通路调节，最终参与炎症反应。

4.3 两栖类TLRs通路中相关分子的表达研究

黄莉莉[37]用RACE法克隆得到中国大鲵(Andriasdavidianus)TLR7(Cgs TLR7)和MyD88(Cgs MyD88)的cDNA全长。SMART预测Cgs TLR7的结构与哺乳动物结构相似，而Cgs TLR7胞外富含亮氨酸重复序列的片段(LRRs)是19个，多于人类、鸡和斑马鱼，较多的LRR基序可能有助于Cgs TLR7对病原的识别；系统发育树分析表明，Cgs TLR7与禽类和爬行类处于同一分支，与鱼类、哺乳类处于不同分支。CgsMyD88与哺乳动物一样包含DD结构域和TIR结构域两个保守结构域，且TIR结构域包含3个Box区域，与CgsMyD88和TLRs的结合、三维结构的形成、诱导下游反应的进行等功能相关；进化树分析结果表明CgsMyD88与爬行类、禽类和哺乳类聚为一个亚群，与爬行类亲缘关系更近。这与Niu等[53]的研究结果相似，东北林蛙MyD88分子的系统发育关系同样与爬行类、鸟类、哺乳类较近，与鱼类较远。Q-PCR实验结果显示，Cgs TLR7和CgsMyD88 mRNA在大鲵脑、皮、肌肉和主要脏器组织中呈组成型表达，其中Cgs TLR7 mRNA的表达在肝脏最高、肾脏次之、肠最低，CgsMyD88 mRNA的表达在肾脏最高、心脾次之、肌肉和肝脏最低。最后对CgsMyD88构建真核表达载体，转染大鲵肌肉细胞系，间接荧光免疫化学染色对CgsMyD88在GS-M细胞的定位结果显示CgsMyD88蛋白在GS-M细胞胞质中大量表达，少部分分布在胞核中，但在此前的研究中哺乳动物和斑马鱼(Daniorerio)中MyD88只定位于细胞质中，只有在鸡成纤维细胞的胞核中观察到MyD88[37]。

Xu等[54]通过东北林蛙皮肤组织高通量测序筛选差异基因鉴别出TLRs通路中多个分子，包括TLR家族成员(TLR1、TLR2、TLR4-6、TLR8和TLR12)、接头分子(MyD88、Mal/TIRAP)以及下游通路中的相关分子(IRAK1、IRAK4、TRAF6、IRF5/7、TAK1、IKKs、TAB1、TAB2、TAB3、NF-κB、IκB等)。随后吴立舒[55]以蛙虹彩病毒胁迫东北林蛙建立东北林蛙皮肤组织中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR8等TLRs的荧光定量PCR方法，发现除TLR1 mRNA 和TLR8 mRNA在病毒胁迫后1 h和6 h出现表达高峰点，其余TLRs mRNA在0—2 h水平下调后2—6 h上调达至高峰，TLR1、TLR4和TLR8 3个分子mRNA上调水平最为显著。吴立舒[55]推测TLR1和TLR8可能具有特异性识别蛙虹彩病毒的功能。周旋[56]、史雪灿[57]、Niu等[53]、邵婕[58]、曲俐俐[59]等分别以蛙虹彩病毒、嗜水气单胞菌等两栖类常见致病菌为胁迫病原菌，用Q-PCR、Western Blot、免疫组织化学染色等技术研究东北林蛙TLR4信号通路中相关分子的表达。这些分子包括MyD88、IRAK4、TRAF6、NF-κB、IKKs、TBK1、IRF3和IRF7等，涉及TLR4信号通路的MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径中的主要分子。综合以上研究发现，在RGV胁迫下，多数组织MyD88依赖途径中如MyD88、TRAF6 等分子mRNA的表达会出现上调，但上调幅度不及非依赖途径中主要分子如TRAF3，此时林蛙对于RGV的免疫应答可能以非依赖途径为主，依赖途径为辅；在AH的胁迫下，非依赖途径中IRF3、IRF7和TBK1 mRNA水平的应答幅度较依赖途径中主要分子如IKKα、IKKβ更小，此时的免疫应答更偏重于依赖途径，非依赖途径则起辅助作用，所以两栖类在面对不同病原体的侵袭时，TLRs下游参与免疫应答的主要途径可能不同。

5 小结

人们普遍认为，地球正在经历一场全球性的生物大规模灭绝事件，而两栖动物是脊椎动物中受威胁程度最为严重的类群[4]。多项研究已经证明Toll样受体在脊椎动物先天性免疫防御反应中发挥重要作用，同时具备刺激调动获得性免疫的作用，但目前在该方面的研究多集中于哺乳类动物，对于两栖类TLRs信号通路的研究仅限于无尾目和有尾目的个别物种。测序技术的快速发展为两栖类免疫基因的研究提供了良好的平台，研究人员对于两栖类TLRs也有了初步的研究和了解。现有的研究认为两栖类TLRs具备鱼类和哺乳类TLRs的特征，两栖类TLRs的数量也介于鱼类和哺乳类之间，TLRs部分成员如TLR2在由鱼类到两栖类到哺乳类的进化过程中配体识别功能可能发生一定程度的特化；其次，TLRs在两栖类发育早期获得性免疫未完善之前发挥重要作用，且随季节的变化免疫功能强度发生一定的变化；在特定病原菌和病毒的胁迫下，两栖类可能调动TLRs下游不同的途径参与机体的免疫应答反应。两栖类TLRs在组成和数量上异于鱼类和哺乳类，而三者TLRs家族成员免疫识别功能也不尽相同，除文章中提到的TLR2外，还有TLR4较为特殊，哺乳动物TLR4可以识别LPS，而斑马鱼TLR4却不能被LPS激活[60]，对已有的两栖类TLR4的研究发现其识别功能和哺乳类更接近，也能被LPS激活。

总体而言，目前对两栖类TLRs的研究尚处于初步阶段，未来研究需要解决的问题和完善的方面还有很多，例如目前对于两栖类TLRs的研究仅限于无尾目和有尾目的极少数物种，这对于从整体水平上了解两栖类TLRs的作用机制和进化规律是远不够的；其次，对两栖类TLRs的研究大多数停留在基因组或转录组水平，在蛋白层面的研究匮乏，需要加强对两栖类TLRs蛋白水平上的研究；此外对于已鉴定出的两栖类TLRs的功能和配体特异性识别机制缺乏深入研究，需加强对两栖类TLRs特异性配体的鉴定；对于两栖类TLRs下游信号通路中信号分子的确定缺乏研究，多数基因还需进一步鉴定；TLRs在机体细胞内广泛分布，两栖类TLRs之间如何准确地协同发挥作用？TLRs引起的持续性的炎症反应会对机体产生损伤，两栖类又是通过哪些调控机制严密地控制TLRs信号通路的活化？TLRs具有高保守性，对于两栖类TLRs的研究又可以揭示一条怎样先天性免疫进化线索呢？所以综合上述问题，对两栖类TLRs的研究依然任重道远。由于两栖类面临的危险处境和特殊的进化地位，对于两栖类机体免疫防御机制的研究越来越受重视，对两栖类TLRs的研究对于探索TLR基因家族的进化模式十分重要，同时帮助了解两栖动物在面对病原微生物侵袭时的免疫应答机制，为两栖类相关物种的疾病防治提供一定思路。随着科技的发展和研究工作的全面展开，两栖类Toll样受体家族的研究也必将取得更深入的进展。